মায়োসিন হেভি চেইনের বাইরে মানব কঙ্কাল পেশী তন্তুর ভিন্নতা

nature.com-এ আসার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন, তাতে CSS-এর সমর্থন সীমিত। সর্বোত্তম অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে ব্রাউজারের সর্বশেষ সংস্করণ ব্যবহার করার (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে কম্প্যাটিবিলিটি মোড নিষ্ক্রিয় করার) পরামর্শ দিচ্ছি। এছাড়াও, নিরবচ্ছিন্ন সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, এই সাইটটি স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট-মুক্ত থাকবে।
কঙ্কাল পেশী একটি ভিন্নধর্মী টিস্যু যা প্রধানত মায়োফাইব্রিল দ্বারা গঠিত, যা মানুষের ক্ষেত্রে সাধারণত তিন প্রকারে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়: একটি "ধীর" (টাইপ ১) এবং দুটি "দ্রুত" (টাইপ ২এ এবং ২এক্স)। তবে, প্রচলিত মায়োফাইব্রিল প্রকারগুলির মধ্যে এবং তাদের নিজেদের মধ্যেকার ভিন্নতা সম্পর্কে এখনও ভালোভাবে বোঝা যায়নি। আমরা মানুষের ভ্যাস্টাস ল্যাটেরালিস থেকে যথাক্রমে ১০৫০ এবং ১০৩৮টি স্বতন্ত্র মায়োফাইব্রিলের উপর ট্রান্সক্রিপ্টোমিক এবং প্রোটিওমিক পদ্ধতি প্রয়োগ করেছি। প্রোটিওমিক গবেষণায় পুরুষদের অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল, এবং ট্রান্সক্রিপ্টোমিক গবেষণায় ১০ জন পুরুষ ও ২ জন মহিলাকে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল। মায়োসিন হেভি চেইন আইসোফর্ম ছাড়াও, আমরা বিপাকীয় প্রোটিন, রাইবোসোমাল প্রোটিন এবং কোষীয় সংযোগ প্রোটিনকে বহুমাত্রিক আন্তঃমায়োফাইব্রিল ভিন্নতার উৎস হিসাবে চিহ্নিত করেছি। অধিকন্তু, ধীর এবং দ্রুত ফাইবারের গুচ্ছ চিহ্নিত করা সত্ত্বেও, আমাদের তথ্য থেকে বোঝা যায় যে টাইপ ২এক্স ফাইবারগুলি ফিনোটাইপিকভাবে অন্যান্য ফাস্ট-টুইচ ফাইবার থেকে আলাদা করা যায় না। অধিকন্তু, নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে মায়োফাইবারের ফেনোটাইপ বর্ণনা করার জন্য মায়োসিন হেভি চেইন-ভিত্তিক শ্রেণিবিন্যাস অপর্যাপ্ত। সামগ্রিকভাবে, আমাদের তথ্য বহুমাত্রিক মায়োফাইবারের ভিন্নতার ইঙ্গিত দেয়, যার ভিন্নতার উৎস মায়োসিন হেভি চেইন আইসোফর্মের বাইরেও বিস্তৃত।
কোষীয় ভিন্নতা সকল জৈবিক তন্ত্রের একটি সহজাত বৈশিষ্ট্য, যা কোষগুলোকে কলা এবং কোষের বিভিন্ন চাহিদা মেটাতে বিশেষায়িত হতে সাহায্য করে।¹ কঙ্কাল পেশী তন্তুর ভিন্নতা সম্পর্কে প্রচলিত ধারণাটি হলো, মোটর নিউরনগুলো একটি মোটর ইউনিটের মধ্যে তন্তুর ধরন নির্ধারণ করে, এবং তন্তুর ধরন (যেমন, মানুষের ক্ষেত্রে টাইপ ১, টাইপ ২এ, এবং টাইপ ২এক্স) মায়োসিন হেভি চেইন (MYH) আইসোফর্মের বৈশিষ্ট্য দ্বারা নির্ধারিত হয়।² এটি প্রাথমিকভাবে তাদের pH ATPase অস্থিতিশীলতার উপর ভিত্তি করে ছিল,³,⁴ এবং পরবর্তীতে MYH-এর আণবিক প্রকাশের উপর ভিত্তি করে ছিল।⁵ তবে, বিভিন্ন অনুপাতে একাধিক MYH সহ-প্রকাশকারী "মিশ্র" তন্তুগুলোর শনাক্তকরণ এবং পরবর্তীকালে স্বীকৃতির সাথে, কঙ্কাল পেশী তন্তুগুলোকে স্বতন্ত্র তন্তুর ধরন হিসেবে না দেখে ক্রমবর্ধমানভাবে একটি অবিচ্ছিন্ন ধারা হিসেবে দেখা হচ্ছে।⁶ তা সত্ত্বেও, এই ক্ষেত্রটি এখনও মায়োফাইবারের শ্রেণিবিন্যাসের জন্য প্রাথমিক শ্রেণিবিন্যাসকারী হিসেবে MYH-এর উপর ব্যাপকভাবে নির্ভর করে, এই দৃষ্টিভঙ্গিটি সম্ভবত ইঁদুরের উপর করা প্রাথমিক গবেষণার সীমাবদ্ধতা এবং উল্লেখযোগ্য পক্ষপাতের দ্বারা প্রভাবিত, যাদের MYH প্রকাশের প্রোফাইল এবং তন্তুর ধরনের পরিসর মানুষের থেকে ভিন্ন।² পরিস্থিতিটি আরও জটিল এই কারণে যে, মানুষের বিভিন্ন কঙ্কাল পেশীতে তন্তুর একটি বৈচিত্র্যময় পরিসর দেখা যায়। প্রকারভেদ।৭ ভ্যাস্টাস ল্যাটেরালিস একটি মিশ্র পেশী যার একটি মধ্যবর্তী (এবং তাই প্রতিনিধিত্বমূলক) MYH এক্সপ্রেশন প্রোফাইল রয়েছে।৭ অধিকন্তু, এর নমুনা সংগ্রহের সহজলভ্যতার কারণে এটি মানবদেহে সবচেয়ে বেশি অধ্যয়ন করা পেশী।
সুতরাং, শক্তিশালী “ওমিক্স” সরঞ্জাম ব্যবহার করে কঙ্কাল পেশী তন্তুর বৈচিত্র্যের নিরপেক্ষ অনুসন্ধান অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ, কিন্তু এটি বেশ কঠিনও বটে, যার একটি কারণ হলো কঙ্কাল পেশী তন্তুর বহু-নিউক্লিয়াসযুক্ত প্রকৃতি। তবে, সাম্প্রতিক বছরগুলিতে বিভিন্ন প্রযুক্তিগত অগ্রগতির কারণে ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স8,9 এবং প্রোটিওমিক্স10 প্রযুক্তির সংবেদনশীলতায় এক বৈপ্লবিক পরিবর্তন এসেছে, যা একক-তন্তু পর্যায়ে কঙ্কাল পেশী বিশ্লেষণের সুযোগ করে দিয়েছে। ফলস্বরূপ, একক-তন্তুর বৈচিত্র্য এবং অ্যাট্রোফিক উদ্দীপনা ও বার্ধক্যের প্রতি তাদের প্রতিক্রিয়া চিহ্নিত করার ক্ষেত্রে উল্লেখযোগ্য অগ্রগতি সাধিত হয়েছে11,12,13,14,15,16,17,18। গুরুত্বপূর্ণভাবে, এই প্রযুক্তিগত অগ্রগতিগুলির ক্লিনিকাল প্রয়োগ রয়েছে, যা রোগ-সম্পর্কিত অব্যবস্থার আরও বিস্তারিত এবং সুনির্দিষ্ট বৈশিষ্ট্য নির্ধারণের সুযোগ করে দেয়। উদাহরণস্বরূপ, সবচেয়ে সাধারণ বংশগত পেশী রোগগুলির মধ্যে অন্যতম নেমালাইন মায়োপ্যাথির (MIM 605355 এবং MIM 161800) প্যাথোফিজিওলজি জটিল এবং বিভ্রান্তিকর।19,20 অতএব, কঙ্কাল পেশী তন্তুগুলির নিয়ন্ত্রণহীনতার আরও ভাল বৈশিষ্ট্য নির্ধারণ এই রোগ সম্পর্কে আমাদের বোঝাপড়ায় উল্লেখযোগ্য অগ্রগতি ঘটাতে পারে।
আমরা মানুষের বায়োপসি নমুনা থেকে হাতে করে আলাদা করা একক কঙ্কাল পেশী তন্তুর ট্রান্সক্রিপ্টোমিক ও প্রোটিওমিক বিশ্লেষণের জন্য পদ্ধতি তৈরি করেছি এবং সেগুলোকে হাজার হাজার তন্তুর উপর প্রয়োগ করেছি, যা আমাদেরকে মানুষের কঙ্কাল পেশী তন্তুর কোষীয় ভিন্নতা অনুসন্ধান করার সুযোগ করে দিয়েছে। এই কাজের প্রক্রিয়ায়, আমরা পেশী তন্তুর ট্রান্সক্রিপ্টোমিক ও প্রোটিওমিক ফেনোটাইপিংয়ের কার্যকারিতা প্রদর্শন করেছি এবং বিপাকীয়, রাইবোসোমাল ও কোষীয় সংযোগকারী প্রোটিনগুলোকে আন্তঃতন্তু ভিন্নতার গুরুত্বপূর্ণ উৎস হিসেবে চিহ্নিত করেছি। অধিকন্তু, এই প্রোটিওমিক কার্যপ্রবাহ ব্যবহার করে, আমরা একক কঙ্কাল পেশী তন্তুতে নেমাটোড মায়োপ্যাথির চিকিৎসাগত প্রাসঙ্গিকতার বৈশিষ্ট্য নিরূপণ করেছি, যা MYH-এর উপর ভিত্তি করে তন্তুর প্রকারভেদ নির্বিশেষে নন-অক্সিডেটিভ তন্তুর দিকে একটি সমন্বিত পরিবর্তন প্রকাশ করে।
মানব কঙ্কাল পেশী তন্তুর ভিন্নতা অনুসন্ধান করার জন্য, আমরা একক কঙ্কাল পেশী তন্তুর ট্রান্সক্রিপ্টোম এবং প্রোটিওম বিশ্লেষণ সক্ষম করতে দুটি কর্মপ্রবাহ তৈরি করেছি (চিত্র 1A এবং পরিপূরক চিত্র 1A)। আমরা নমুনা সংরক্ষণ এবং RNA ও প্রোটিনের অখণ্ডতা রক্ষা থেকে শুরু করে প্রতিটি পদ্ধতির জন্য থ্রুপুট অপ্টিমাইজ করা পর্যন্ত বেশ কয়েকটি পদ্ধতিগত ধাপ তৈরি এবং অপ্টিমাইজ করেছি। ট্রান্সক্রিপ্টোম বিশ্লেষণের জন্য, রিভার্স ট্রান্সক্রিপশনের প্রাথমিক ধাপে নমুনা-নির্দিষ্ট আণবিক বারকোড সন্নিবেশ করে এটি অর্জন করা হয়েছিল, যা কার্যকর ডাউনস্ট্রিম প্রক্রিয়াকরণের জন্য ৯৬টি তন্তুকে একত্রিত করার সুযোগ করে দেয়। প্রচলিত একক-কোষ পদ্ধতির তুলনায় গভীরতর সিকোয়েন্সিং (প্রতি তন্তুতে ±১ মিলিয়ন রিড) ট্রান্সক্রিপ্টোম ডেটাকে আরও সমৃদ্ধ করেছে। ২১ প্রোটিওমিক্সের জন্য, আমরা উচ্চ থ্রুপুট বজায় রেখে প্রোটিওমের গভীরতা অপ্টিমাইজ করার জন্য একটি timsTOF ভর স্পেকট্রোমিটারে DIA-PASEF ডেটা অধিগ্রহণের সাথে একটি সংক্ষিপ্ত ক্রোমাটোগ্রাফিক গ্রেডিয়েন্ট (২১ মিনিট) ব্যবহার করেছি। ২২,২৩ সুস্থ কঙ্কাল পেশী তন্তুর ভিন্নতা তদন্ত করার জন্য, আমরা ১৪ জন সুস্থ প্রাপ্তবয়স্ক দাতার ১,০৫০টি স্বতন্ত্র তন্তুর ট্রান্সক্রিপ্টোম এবং ৫ জন সুস্থ প্রাপ্তবয়স্ক দাতার ১,০৩৮টি তন্তুর প্রোটিওমের বৈশিষ্ট্য নিরূপণ করেছি (পরিপূরক সারণি ১)। এই গবেষণাপত্রে, এই ডেটাসেটগুলিকে যথাক্রমে ১,০০০-তন্তু ট্রান্সক্রিপ্টোম এবং প্রোটিওম হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে। আমাদের পদ্ধতিটি ১,০০০-তন্তু ট্রান্সক্রিপ্টোমিক এবং প্রোটিওমিক বিশ্লেষণে মোট ২৭,২৩৭টি ট্রান্সক্রিপ্ট এবং ২,৯৮৩টি প্রোটিন সনাক্ত করেছে (চিত্র ১এ, পরিপূরক ডেটাসেট ১-২)। প্রতি তন্তুতে >১,০০০ সনাক্তকৃত জিন এবং ৫০% বৈধ মানের জন্য ট্রান্সক্রিপ্টোমিক এবং প্রোটিওমিক ডেটাসেটগুলি ফিল্টার করার পরে, ট্রান্সক্রিপ্টোম এবং প্রোটিওমে যথাক্রমে ৯২৫ এবং ৯৭৪টি তন্তুর জন্য পরবর্তী বায়োইনফরমেটিক্স বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ফিল্টার করার পর, প্রতি ফাইবারে গড়ে ৪২৫৭ ± ১৫৫৭টি জিন এবং ২০১৫ ± ২৩৪টি প্রোটিন (গড় ± এসডি) শনাক্ত করা হয়েছে, যেখানে ব্যক্তিভেদে তারতম্য ছিল সীমিত (পরিশিষ্ট চিত্র ১বি–সি, পরিশিষ্ট ডেটাসেট ৩–৪)। তবে, অংশগ্রহণকারীদের মধ্যে একই ব্যক্তির ক্ষেত্রে তারতম্য ছিল বেশি প্রকট, যা সম্ভবত বিভিন্ন দৈর্ঘ্য ও প্রস্থচ্ছেদের ফাইবারের মধ্যে আরএনএ/প্রোটিনের পরিমাণের পার্থক্যের কারণে ঘটেছে। বেশিরভাগ প্রোটিনের (২০০০-এর বেশি) ক্ষেত্রে, ভেদ গুণাঙ্ক ২০%-এর নিচে ছিল (পরিশিষ্ট চিত্র ১ডি)। উভয় পদ্ধতিই পেশী সংকোচনের জন্য গুরুত্বপূর্ণ উচ্চমাত্রায় প্রকাশিত বৈশিষ্ট্যযুক্ত ট্রান্সক্রিপ্ট এবং প্রোটিনের (যেমন, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) একটি বিস্তৃত ডাইনামিক রেঞ্জ শনাক্ত করতে সক্ষম হয়েছে (পরিশিষ্ট চিত্র ১ই–এফ)। শনাক্তকৃত বৈশিষ্ট্যগুলোর অধিকাংশই ট্রান্সক্রিপ্টোমিক এবং প্রোটিওমিক ডেটাসেটগুলোর মধ্যে অভিন্ন ছিল (পরিশিষ্ট চিত্র 1G), এবং এই বৈশিষ্ট্যগুলোর গড় UMI/LFQ তীব্রতাগুলো যুক্তিসঙ্গতভাবে ভালোভাবে সম্পর্কযুক্ত ছিল (r = 0.52) (পরিশিষ্ট চিত্র 1H)।
ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স এবং প্রোটিওমিক্স ওয়ার্কফ্লো (BioRender.com দিয়ে তৈরি)। BD MYH7, MYH2, এবং MYH1-এর জন্য ডায়নামিক রেঞ্জ কার্ভ, এবং ফাইবার টাইপ নির্ধারণের জন্য গণনাকৃত থ্রেশহোল্ড। E, F ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স এবং প্রোটিওমিক্স ডেটাসেটে ফাইবার জুড়ে MYH এক্সপ্রেশনের বন্টন। G, H MYH-ভিত্তিক ফাইবার টাইপ অনুসারে রঙিন ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স এবং প্রোটিওমিক্সের জন্য ইউনিফর্ম ডাইভারসিটি অ্যাপ্রক্সিমেশন অ্যান্ড প্রোজেকশন (UMAP) প্লট। I, J ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স এবং প্রোটিওমিক্স ডেটাসেটে MYH7, MYH2, এবং MYH1 এক্সপ্রেশন দেখানো ফিচার প্লট।
আমরা প্রাথমিকভাবে ওমিক্স ডেটাসেটে MYH এক্সপ্রেশনের উচ্চ সংবেদনশীলতা এবং ডায়নামিক রেঞ্জের সুবিধা নিয়ে একটি অপ্টিমাইজড পদ্ধতি ব্যবহার করে প্রতিটি ফাইবারের জন্য MYH-ভিত্তিক ফাইবার টাইপ নির্ধারণ করার কাজ শুরু করি। পূর্ববর্তী গবেষণায় বিভিন্ন MYH-এর এক্সপ্রেশনের একটি নির্দিষ্ট শতাংশের উপর ভিত্তি করে ফাইবারগুলিকে বিশুদ্ধ টাইপ 1, টাইপ 2A, টাইপ 2X, বা মিশ্র হিসাবে চিহ্নিত করার জন্য যথেচ্ছ থ্রেশহোল্ড ব্যবহার করা হয়েছে¹¹,¹⁴,²⁴। আমরা একটি ভিন্ন পদ্ধতি ব্যবহার করেছি যেখানে প্রতিটি ফাইবারের এক্সপ্রেশনকে সেই MYH-গুলো দ্বারা র‍্যাঙ্ক করা হয়েছে যা আমরা ফাইবারগুলির টাইপ নির্ধারণ করতে ব্যবহার করেছি: MYH7, MYH2, এবং MYH1, যা যথাক্রমে টাইপ 1, টাইপ 2A, এবং টাইপ 2X ফাইবারের সাথে সম্পর্কিত। এরপর আমরা গাণিতিকভাবে প্রতিটি প্রাপ্ত কার্ভের নিম্ন ইনফ্লেকশন পয়েন্ট গণনা করেছি এবং প্রতিটি MYH-এর জন্য ফাইবারগুলিকে পজিটিভ (থ্রেশহোল্ডের উপরে) বা নেগেটিভ (থ্রেশহোল্ডের নিচে) হিসাবে নির্ধারণ করতে এটিকে একটি থ্রেশহোল্ড হিসাবে ব্যবহার করেছি (চিত্র 1B–D)। এই ডেটা প্রমাণ করে যে প্রোটিন স্তরের তুলনায় RNA স্তরে MYH7 (চিত্র 1B) এবং MYH2 (চিত্র 1C)-এর আরও স্বতন্ত্র অন/অফ এক্সপ্রেশন প্রোফাইল রয়েছে। প্রকৃতপক্ষে, প্রোটিন স্তরে, খুব কম ফাইবারই MYH7 প্রকাশ করেনি, এবং কোনো ফাইবারেই ১০০% MYH2 প্রকাশ ছিল না। এরপর আমরা প্রতিটি ডেটাসেটের সমস্ত ফাইবারকে MYH-ভিত্তিক ফাইবারের প্রকারভেদ নির্ধারণ করার জন্য পূর্বনির্ধারিত প্রকাশের থ্রেশহোল্ড ব্যবহার করেছি। উদাহরণস্বরূপ, MYH7+/MYH2-/MYH1- ফাইবারগুলোকে টাইপ ১-এ নির্ধারণ করা হয়েছিল, যেখানে MYH7-/MYH2+/MYH1+ ফাইবারগুলোকে মিশ্র টাইপ 2A/2X-এ নির্ধারণ করা হয়েছিল (সম্পূর্ণ বিবরণের জন্য পরিপূরক সারণি ২ দেখুন)। সমস্ত ফাইবারকে একত্রিত করে, আমরা RNA (চিত্র 1E) এবং প্রোটিন (চিত্র 1F) উভয় স্তরেই MYH-ভিত্তিক ফাইবারের প্রকারভেদের একটি লক্ষণীয়ভাবে একই রকম বিন্যাস লক্ষ্য করেছি, যদিও প্রত্যাশিতভাবেই MYH-ভিত্তিক ফাইবারের প্রকারভেদের আপেক্ষিক গঠন ব্যক্তিভেদে ভিন্ন ছিল (পরিপূরক চিত্র 2A)। বেশিরভাগ ফাইবারকে বিশুদ্ধ টাইপ ১ (৩৪-৩৫%) বা টাইপ 2A (৩৬-৩৮%) হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল, যদিও উল্লেখযোগ্য সংখ্যক মিশ্র টাইপ 2A/2X ফাইবারও (১৬-১৯%) সনাক্ত করা হয়েছিল। একটি উল্লেখযোগ্য পার্থক্য হলো যে বিশুদ্ধ টাইপ 2X ফাইবার শুধুমাত্র RNA স্তরে সনাক্ত করা সম্ভব হয়েছিল, কিন্তু প্রোটিন স্তরে নয়, যা থেকে বোঝা যায় যে দ্রুত MYH অভিব্যক্তি অন্তত আংশিকভাবে ট্রান্সক্রিপশন-পরবর্তী পর্যায়ে নিয়ন্ত্রিত হয়।
আমরা অ্যান্টিবডি-ভিত্তিক ডট ব্লটিং ব্যবহার করে আমাদের প্রোটিওমিক্স-ভিত্তিক MYH ফাইবার টাইপিং পদ্ধতির বৈধতা যাচাই করেছি, এবং উভয় পদ্ধতিই বিশুদ্ধ টাইপ ১ এবং টাইপ ২এ ফাইবার শনাক্তকরণে ১০০% সামঞ্জস্য অর্জন করেছে (পরিশিষ্ট চিত্র ২বি দেখুন)। তবে, প্রোটিওমিক্স-ভিত্তিক পদ্ধতিটি মিশ্র ফাইবার শনাক্তকরণে অধিক সংবেদনশীল ও কার্যকর ছিল এবং প্রতিটি ফাইবারে প্রতিটি MYH জিনের অনুপাত পরিমাপ করতে সক্ষম ছিল। এই তথ্যগুলো কঙ্কাল পেশীর ফাইবারের প্রকারভেদ নির্ণয়ের জন্য একটি বস্তুনিষ্ঠ, অত্যন্ত সংবেদনশীল ওমিক্স-ভিত্তিক পদ্ধতি ব্যবহারের কার্যকারিতা প্রমাণ করে।
এরপর আমরা ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স এবং প্রোটিওমিক্স থেকে প্রাপ্ত সম্মিলিত তথ্য ব্যবহার করে মায়োফাইবারের সম্পূর্ণ ট্রান্সক্রিপ্টোম বা প্রোটিওমের উপর ভিত্তি করে সেগুলোকে বস্তুনিষ্ঠভাবে শ্রেণীবদ্ধ করেছি। ইউনিফর্ম ম্যানিফোল্ড অ্যাপ্রক্সিমেশন অ্যান্ড প্রোজেকশন (UMAP) পদ্ধতি ব্যবহার করে ডাইমেনশনালিটি কমিয়ে ছয়টি প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্টে (পরিপূরক চিত্র 3A–B) আনার পর, আমরা ট্রান্সক্রিপ্টোমে (চিত্র 1G) এবং প্রোটিওমে (চিত্র 1H) মায়োফাইবারের পরিবর্তনশীলতা দৃশ্যমান করতে সক্ষম হয়েছি। লক্ষণীয়ভাবে, ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স বা প্রোটিওমিক্স ডেটাসেট কোনোটিতেই মায়োফাইবারগুলোকে অংশগ্রহণকারী (পরিপূরক চিত্র 3C–D) বা পরীক্ষার দিন (পরিপূরক চিত্র 3E) অনুসারে দলবদ্ধ করা হয়নি, যা থেকে বোঝা যায় যে কঙ্কাল পেশীর ফাইবারের মধ্যে ব্যক্তি-অভ্যন্তরীণ পরিবর্তনশীলতা ব্যক্তি-বহির্ভূত পরিবর্তনশীলতার চেয়ে বেশি। UMAP প্লটে, "দ্রুত" এবং "ধীর" মায়োফাইবারের প্রতিনিধিত্বকারী দুটি স্বতন্ত্র ক্লাস্টার আবির্ভূত হয়েছে (চিত্র 1G–H)। MYH7+ (ধীরগতির) মায়োফাইবারগুলো UMAP1-এর ধনাত্মক প্রান্তে গুচ্ছবদ্ধ ছিল, অপরদিকে MYH2+ এবং MYH1+ (দ্রুতগতির) মায়োফাইবারগুলো UMAP1-এর ঋণাত্মক প্রান্তে গুচ্ছবদ্ধ ছিল (চিত্র ১I–J)। তবে, MYH এক্সপ্রেশনের উপর ভিত্তি করে ফাস্ট-টুইচ ফাইবারের প্রকারভেদের (যেমন, টাইপ 2A, টাইপ 2X, বা মিশ্র 2A/2X) মধ্যে কোনো পার্থক্য করা যায়নি, যা থেকে বোঝা যায় যে সম্পূর্ণ ট্রান্সক্রিপ্টোম বা প্রোটিওম বিবেচনা করলে MYH1 (চিত্র ১I–J) বা অন্যান্য ক্লাসিক্যাল 2X মায়োফাইবার মার্কার যেমন ACTN3 বা MYLK2 (পরিপূরক চিত্র ৪A–B)-এর এক্সপ্রেশন বিভিন্ন মায়োফাইবারের প্রকারভেদের মধ্যে পার্থক্য করতে পারে না। অধিকন্তু, MYH2 এবং MYH7-এর তুলনায়, খুব কম সংখ্যক ট্রান্সক্রিপ্ট বা প্রোটিন MYH1-এর সাথে ধনাত্মকভাবে সম্পর্কিত ছিল (পরিপূরক চিত্র ৪C–H), যা থেকে বোঝা যায় যে MYH1-এর প্রাচুর্য মায়োফাইবারের ট্রান্সক্রিপ্টোম/প্রোটিওমকে সম্পূর্ণরূপে প্রতিফলিত করে না। UMAP স্তরে তিনটি MYH আইসোফর্মের মিশ্র অভিব্যক্তি মূল্যায়ন করার সময়ও অনুরূপ সিদ্ধান্তে উপনীত হওয়া গেছে (পরিপূরক চিত্র ৪I–J)। সুতরাং, যদিও শুধুমাত্র MYH পরিমাণ নির্ধারণের উপর ভিত্তি করে ট্রান্সক্রিপ্ট স্তরে 2X ফাইবার শনাক্ত করা যায়, সম্পূর্ণ ট্রান্সক্রিপ্টোম বা প্রোটিওম বিবেচনা করলে MYH1+ ফাইবারগুলোকে অন্যান্য দ্রুত ফাইবার থেকে আলাদা করা যায় না।
MYH-এর বাইরে স্লো ফাইবারের ভিন্নতার প্রাথমিক অনুসন্ধান হিসেবে, আমরা চারটি প্রতিষ্ঠিত স্লো ফাইবার টাইপ-নির্দিষ্ট প্রোটিন মূল্যায়ন করেছি: TPM3, TNNT1, MYL3, এবং ATP2A22। স্লো ফাইবারের উপপ্রকারগুলো ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স (পরিপূরক চিত্র 5A) এবং প্রোটিওমিক্স (পরিপূরক চিত্র 5B) উভয় ক্ষেত্রেই MYH7-এর সাথে উচ্চ, যদিও নিখুঁত নয়, পিয়ারসন কোরিলেশন দেখিয়েছে। ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স (পরিপূরক চিত্র 5C) এবং প্রোটিওমিক্স (পরিপূরক চিত্র 5D)-এ যথাক্রমে প্রায় ২৫% এবং ৩৩% স্লো ফাইবারকে সমস্ত জিন/প্রোটিন উপপ্রকার দ্বারা বিশুদ্ধ স্লো ফাইবার হিসেবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়নি। অতএব, একাধিক জিন/প্রোটিন উপপ্রকারের উপর ভিত্তি করে স্লো ফাইবারের শ্রেণিবিন্যাস অতিরিক্ত জটিলতা সৃষ্টি করে, এমনকি ফাইবার টাইপ-নির্দিষ্ট হিসেবে পরিচিত প্রোটিনগুলোর ক্ষেত্রেও। এটি ইঙ্গিত দেয় যে একটি একক জিন/প্রোটিন পরিবারের আইসোফর্মের উপর ভিত্তি করে ফাইবারের শ্রেণিবিন্যাস কঙ্কাল পেশী ফাইবারের প্রকৃত ভিন্নতাকে পর্যাপ্তভাবে প্রতিফলিত নাও করতে পারে।
সম্পূর্ণ ওমিক্স মডেলের পরিসরে মানব কঙ্কাল পেশী তন্তুর ফিনোটাইপিক পরিবর্তনশীলতা আরও অন্বেষণ করার জন্য, আমরা প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিস (PCA) ব্যবহার করে ডেটার পক্ষপাতহীন ডাইমেনশনালিটি রিডাকশন করেছি (চিত্র 2A)। UMAP প্লটের মতোই, PCA পর্যায়ে অংশগ্রহণকারী বা পরীক্ষার দিন কোনোটিই তন্তুর ক্লাস্টারিংকে প্রভাবিত করেনি (পরিপূরক চিত্র 6A–C)। উভয় ডেটাসেটেই, MYH-ভিত্তিক তন্তুর ধরন PC2 দ্বারা ব্যাখ্যা করা হয়েছে, যা স্লো-টুইচ টাইপ 1 তন্তুর একটি ক্লাস্টার এবং ফাস্ট-টুইচ টাইপ 2A, টাইপ 2X, এবং মিশ্র 2A/2X তন্তু সমন্বিত একটি দ্বিতীয় ক্লাস্টার দেখিয়েছে (চিত্র 2A)। উভয় ডেটাসেটেই, এই দুটি ক্লাস্টার অল্প সংখ্যক মিশ্র টাইপ 1/2A তন্তু দ্বারা সংযুক্ত ছিল। প্রত্যাশিতভাবেই, প্রধান PC ড্রাইভারগুলির ওভাররিপ্রেজেন্টেশন অ্যানালাইসিস নিশ্চিত করেছে যে PC2 সংকোচনশীল এবং বিপাকীয় বৈশিষ্ট্য দ্বারা চালিত ছিল (চিত্র 2B এবং পরিপূরক চিত্র 6D–E, পরিপূরক ডেটাসেট 5–6)। সামগ্রিকভাবে, MYH-ভিত্তিক ফাইবার টাইপ PC2 বরাবর অবিচ্ছিন্ন পরিবর্তন ব্যাখ্যা করার জন্য যথেষ্ট বলে প্রমাণিত হয়েছে, তবে ফাস্ট ক্লাস্টারের মধ্যে ট্রান্সক্রিপ্টোম জুড়ে বিস্তৃত তথাকথিত 2X ফাইবারগুলো এর ব্যতিক্রম।
A. MYH-এর উপর ভিত্তি করে ফাইবারের ধরন অনুযায়ী রঙিন করা ট্রান্সক্রিপ্টোম এবং প্রোটিওম ডেটাসেটের প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিস (PCA) প্লট। B. PC2 এবং PC1-এ ট্রান্সক্রিপ্ট এবং প্রোটিন ড্রাইভারের এনরিচমেন্ট অ্যানালাইসিস। পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ clusterProfiler প্যাকেজ এবং Benjamini-Hochberg অ্যাডজাস্টেড p-মান ব্যবহার করে করা হয়েছে। C, D. ট্রান্সক্রিপ্টোমে ইন্টারসেলুলার অ্যাডহেশন জিন অন্টোলজি (GO) টার্ম এবং প্রোটিওমে কস্টামিয়ার GO টার্ম অনুযায়ী রঙিন করা PCA প্লট। তীরচিহ্নগুলো ট্রান্সক্রিপ্ট এবং প্রোটিন ড্রাইভার ও তাদের দিক নির্দেশ করে। E, F. ক্লিনিক্যালি প্রাসঙ্গিক ফিচারগুলোর ইউনিফর্ম ম্যানিফোল্ড অ্যাপ্রক্সিমেশন অ্যান্ড প্রোজেকশন (UMAP) ফিচার প্লট, যা স্লো/ফাস্ট ফাইবারের ধরন নির্বিশেষে এক্সপ্রেশন গ্রেডিয়েন্ট প্রদর্শন করে। G, H. ট্রান্সক্রিপ্টোম এবং প্রোটিওমে PC2 এবং PC1 ড্রাইভারগুলোর মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ক।
অপ্রত্যাশিতভাবে, MYH-ভিত্তিক মায়োফাইবারের ধরণ শুধুমাত্র দ্বিতীয় সর্বোচ্চ মাত্রার পরিবর্তনশীলতা (PC2) ব্যাখ্যা করেছে, যা ইঙ্গিত দেয় যে MYH-ভিত্তিক মায়োফাইবারের ধরনের (PC1) সাথে সম্পর্কহীন অন্যান্য জৈবিক উপাদান কঙ্কাল পেশী ফাইবারের ভিন্নতা নিয়ন্ত্রণে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। PC1-এর শীর্ষ চালকগুলির ওভাররিপ্রেজেন্টেশন বিশ্লেষণ থেকে জানা যায় যে, PC1-এর পরিবর্তনশীলতা প্রধানত ট্রান্সক্রিপ্টোমে কোষ-কোষ আসঞ্জন এবং রাইবোসোমের পরিমাণ, এবং প্রোটিওমে কস্টামিয়ার এবং রাইবোসোমাল প্রোটিন দ্বারা নির্ধারিত হয় (চিত্র 2B এবং পরিপূরক চিত্র 6D–E, পরিপূরক ডেটা সেট 7)। কঙ্কাল পেশীতে, কস্টামিয়ার Z-ডিস্ককে সারকোলেমার সাথে সংযুক্ত করে এবং বল সঞ্চালন ও সংকেত প্রদানে জড়িত থাকে। 25 কোষ-কোষ আসঞ্জন (ট্রান্সক্রিপ্টোম, চিত্র 2C) এবং কস্টামিয়ার (প্রোটিওম, চিত্র 2D) বৈশিষ্ট্য ব্যবহার করে টীকাযুক্ত PCA প্লটগুলি PC1-এ একটি শক্তিশালী বামমুখী স্থানান্তর প্রকাশ করেছে, যা নির্দেশ করে যে এই বৈশিষ্ট্যগুলি নির্দিষ্ট ফাইবারে সমৃদ্ধ।
UMAP স্তরে মায়োফাইবারের গুচ্ছবদ্ধতার আরও বিশদ পরীক্ষায় দেখা গেছে যে, বেশিরভাগ বৈশিষ্ট্যই মায়োফাইবারের উপগুচ্ছ-নির্দিষ্ট না হয়ে, বরং মায়োফাইবারের প্রকার-নিরপেক্ষ MYH-ভিত্তিক অভিব্যক্তির ক্রমিকতা প্রদর্শন করে। এই ধারাবাহিকতা বিভিন্ন রোগগত অবস্থার সাথে সম্পর্কিত বেশ কয়েকটি জিনের ক্ষেত্রে পরিলক্ষিত হয়েছে (চিত্র 2E), যেমন CHCHD10 (স্নায়ুপেশীর রোগ), SLIT3 (পেশীর ক্ষয়), CTDNEP1 (পেশীর রোগ)। এই ধারাবাহিকতা প্রোটিওম জুড়েও পরিলক্ষিত হয়েছে, যার মধ্যে স্নায়বিক ব্যাধি (UGDH), ইনসুলিন সংকেত (PHIP), এবং ট্রান্সক্রিপশন (HIST1H2AB)-এর সাথে সম্পর্কিত প্রোটিনগুলোও অন্তর্ভুক্ত (চিত্র 2F)। সম্মিলিতভাবে, এই তথ্যগুলো বিভিন্ন মায়োফাইবারের মধ্যে ফাইবারের প্রকার-নিরপেক্ষ ধীর/দ্রুত সংকোচনশীলতার ভিন্নতার ধারাবাহিকতা নির্দেশ করে।
মজার ব্যাপার হলো, PC2-এর ড্রাইভার জিনগুলো ভালো ট্রান্সক্রিপ্টোম-প্রোটিওম পারস্পরিক সম্পর্ক (r = 0.663) দেখিয়েছে (চিত্র 2G), যা থেকে বোঝা যায় যে স্লো-টুইচ এবং ফাস্ট-টুইচ ফাইবার টাইপ, এবং বিশেষ করে কঙ্কাল পেশী ফাইবারের সংকোচনশীল ও বিপাকীয় বৈশিষ্ট্যগুলো ট্রান্সক্রিপশনালি নিয়ন্ত্রিত হয়। তবে, PC1-এর ড্রাইভার জিনগুলো কোনো ট্রান্সক্রিপ্টোম-প্রোটিওম পারস্পরিক সম্পর্ক (r = -0.027) দেখায়নি (চিত্র 2H), যা থেকে বোঝা যায় যে স্লো/ফাস্ট-টুইচ ফাইবার টাইপের সাথে সম্পর্কহীন ভ্যারিয়েশনগুলো মূলত পোস্ট-ট্রান্সক্রিপশনালি নিয়ন্ত্রিত হয়। যেহেতু PC1-এর ভ্যারিয়েশনগুলো প্রাথমিকভাবে রাইবোসোমাল জিন অনটোলজি টার্ম দ্বারা ব্যাখ্যা করা হয়েছিল, এবং যেহেতু রাইবোসোমগুলো প্রোটিন ট্রান্সলেশনে সক্রিয়ভাবে অংশগ্রহণ ও প্রভাব ফেলার মাধ্যমে কোষে একটি গুরুত্বপূর্ণ এবং বিশেষায়িত ভূমিকা পালন করে,31 তাই আমরা পরবর্তীকালে এই অপ্রত্যাশিত রাইবোসোমাল হেটেরোজেনিটি তদন্ত করতে শুরু করি।
আমরা প্রথমে GOCC টার্ম “সাইটোপ্লাজমিক রাইবোসোম”-এ প্রোটিনের আপেক্ষিক প্রাচুর্য অনুসারে প্রোটিওমিক্স প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিস প্লটটিকে রঙিন করেছি (চিত্র 3A)। যদিও এই টার্মটি PC1-এর ধনাত্মক দিকে সমৃদ্ধ, যার ফলে একটি ছোট গ্রেডিয়েন্ট তৈরি হয়, রাইবোসোমাল প্রোটিনগুলো PC1-এর উভয় দিকেই বিভাজনকে চালিত করে (চিত্র 3A)। PC1-এর ঋণাত্মক দিকে সমৃদ্ধ রাইবোসোমাল প্রোটিনগুলোর মধ্যে ছিল RPL18, RPS18, এবং RPS13 (চিত্র 3B), অন্যদিকে PC1-এর ধনাত্মক দিকের প্রধান চালক ছিল RPL31, RPL35, এবং RPL38 (চিত্র 3C)। মজার বিষয় হলো, অন্যান্য টিস্যুর তুলনায় কঙ্কাল পেশীতে RPL38 এবং RPS13 উচ্চ মাত্রায় প্রকাশিত হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 7A)। PC1-এর এই স্বতন্ত্র রাইবোসোমাল বৈশিষ্ট্যগুলো ট্রান্সক্রিপ্টোমে পরিলক্ষিত হয়নি (পরিপূরক চিত্র 7B), যা ট্রান্সক্রিপশন-পরবর্তী নিয়ন্ত্রণের ইঙ্গিত দেয়।
A. প্রোটিওম জুড়ে সাইটোপ্লাজমিক রাইবোসোমাল জিন অনটোলজি (GO) টার্ম অনুসারে রঙিন প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিস (PCA) প্লট। তীরচিহ্নগুলো PCA প্লটে প্রোটিন-জনিত পরিবর্তনের দিক নির্দেশ করে। রেখার দৈর্ঘ্য একটি নির্দিষ্ট প্রোটিনের জন্য প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট স্কোরের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ। B, C. RPS13 এবং RPL38-এর জন্য PCA ফিচার প্লট। D. সাইটোপ্লাজমিক রাইবোসোমাল প্রোটিনের আনসুপারভাইজড হায়ারারকিক্যাল ক্লাস্টারিং অ্যানালাইসিস। E. 80S রাইবোসোমের গাঠনিক মডেল (PDB: 4V6X), যা কঙ্কাল পেশী তন্তুতে বিভিন্ন প্রাচুর্যের রাইবোসোমাল প্রোটিনগুলোকে তুলে ধরে। F. mRNA নির্গমন পথের কাছাকাছি অবস্থিত বিভিন্ন স্টোইকিওমেট্রির রাইবোসোমাল প্রোটিন।
রাইবোসোমাল হেটেরোজেনিটি এবং স্পেশালাইজেশনের ধারণা পূর্বে প্রস্তাব করা হয়েছে, যেখানে স্বতন্ত্র রাইবোসোম উপগোষ্ঠীর উপস্থিতি (রাইবোসোমাল হেটেরোজেনিটি) নির্দিষ্ট mRNA ট্রান্সক্রিপ্ট পুলের নির্বাচনী অনুবাদের মাধ্যমে বিভিন্ন টিস্যু³² এবং কোষ³³-এ প্রোটিন অনুবাদকে সরাসরি প্রভাবিত করতে পারে³⁴ (রাইবোসোম স্পেশালাইজেশন)। কঙ্কাল পেশী তন্তুতে সহ-প্রকাশিত রাইবোসোমাল প্রোটিনের উপগোষ্ঠী শনাক্ত করার জন্য, আমরা প্রোটিওমে রাইবোসোমাল প্রোটিনের একটি আনসুপারভাইজড হায়ারারকিক্যাল ক্লাস্টারিং বিশ্লেষণ করেছি (চিত্র 3D, পরিপূরক ডেটা সেট 8)। প্রত্যাশিতভাবেই, MYH-এর উপর ভিত্তি করে রাইবোসোমাল প্রোটিনগুলো তন্তুর ধরন অনুসারে ক্লাস্টারবদ্ধ হয়নি। তবে, আমরা রাইবোসোমাল প্রোটিনের তিনটি স্বতন্ত্র ক্লাস্টার শনাক্ত করেছি; প্রথম ক্লাস্টারটি (রাইবোসোমাল_ক্লাস্টার_1) RPL³⁸-এর সাথে সহ-নিয়ন্ত্রিত এবং তাই একটি ইতিবাচক PC1 প্রোফাইলযুক্ত তন্তুতে এর প্রকাশ বৃদ্ধি পায়। দ্বিতীয় ক্লাস্টারটি (রাইবোসোমাল_ক্লাস্টার_2) RPS¹³-এর সাথে সহ-নিয়ন্ত্রিত এবং একটি নেতিবাচক PC1 প্রোফাইলযুক্ত তন্তুতে এর প্রকাশ বৃদ্ধি পায়। তৃতীয় ক্লাস্টার (রাইবোসোমাল ক্লাস্টার ৩) কঙ্কাল পেশী তন্তুতে সমন্বিত ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন দেখায় না এবং এটিকে কঙ্কাল পেশীর "মূল" রাইবোসোমাল প্রোটিন হিসেবে বিবেচনা করা যেতে পারে। রাইবোসোমাল ক্লাস্টার ১ এবং ২ উভয়টিতেই এমন রাইবোসোমাল প্রোটিন রয়েছে যা পূর্বে অল্টারনেটিভ ট্রান্সলেশন নিয়ন্ত্রণ করতে (যেমন, RPL10A, RPL38, RPS19, এবং RPS25) এবং কার্যকরীভাবে বিকাশকে প্রভাবিত করতে (যেমন, RPL10A, RPL38) দেখা গেছে।৩৪,৩৫,৩৬,৩৭,৩৮ পিসিএ (PCA) ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্য রেখে, তন্তু জুড়ে এই রাইবোসোমাল প্রোটিনগুলির পর্যবেক্ষণকৃত ভিন্নধর্মী প্রতিনিধিত্বও ধারাবাহিকতা দেখিয়েছে (পরিপূরক চিত্র ৭সি)।
রাইবোসোমের মধ্যে ভিন্নধর্মী রাইবোসোমাল প্রোটিনের অবস্থান দৃশ্যমান করার জন্য, আমরা মানব 80S রাইবোসোমের একটি কাঠামোগত মডেল (প্রোটিন ডেটা ব্যাংক: 4V6X) ব্যবহার করেছি (চিত্র 3E)। বিভিন্ন রাইবোসোমাল ক্লাস্টারের অন্তর্গত রাইবোসোমাল প্রোটিনগুলোকে পৃথক করার পর, তাদের অবস্থানগুলো ঘনিষ্ঠভাবে সারিবদ্ধ ছিল না, যা থেকে বোঝা যায় যে আমাদের পদ্ধতিটি রাইবোসোমের নির্দিষ্ট কিছু অঞ্চল/অংশের জন্য সমৃদ্ধি প্রদানে ব্যর্থ হয়েছে। তবে, মজার বিষয় হলো, ক্লাস্টার ২-এ বৃহৎ সাবইউনিট প্রোটিনের অনুপাত ক্লাস্টার ১ এবং ৩-এর তুলনায় কম ছিল (পরিপূরক চিত্র 7D)। আমরা লক্ষ্য করেছি যে কঙ্কাল পেশী তন্তুতে পরিবর্তিত স্টোইকিওমেট্রিযুক্ত প্রোটিনগুলো প্রধানত রাইবোসোমের পৃষ্ঠে অবস্থান করে (চিত্র 3E), যা বিভিন্ন mRNA পপুলেশনে অভ্যন্তরীণ রাইবোসোম এন্ট্রি সাইট (IRES) উপাদানের সাথে মিথস্ক্রিয়া করার এবং এর মাধ্যমে নির্বাচনী অনুবাদ সমন্বয় করার ক্ষমতার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। ৪০, ৪১ অধিকন্তু, কঙ্কাল পেশী তন্তুতে পরিবর্তিত স্টোইকিওমেট্রিযুক্ত অনেক প্রোটিন mRNA এক্সিট টানেলের (চিত্র 3F) মতো কার্যকরী অঞ্চলের কাছাকাছি অবস্থিত ছিল, যা নির্দিষ্ট পেপটাইডের ট্রান্সলেশনাল ইলোঙ্গেশন এবং অ্যারেস্টকে বেছে বেছে নিয়ন্ত্রণ করে। ৪২ সারসংক্ষেপে, আমাদের তথ্য থেকে বোঝা যায় যে কঙ্কাল পেশীর রাইবোসোমাল প্রোটিনের স্টোইকিওমেট্রিতে ভিন্নতা রয়েছে, যার ফলে কঙ্কাল পেশী তন্তুগুলির মধ্যে পার্থক্য দেখা যায়।
এরপর আমরা ফাস্ট-টুইচ ও স্লো-টুইচ ফাইবারের বৈশিষ্ট্যসূচক চিহ্নগুলো শনাক্ত করতে এবং তাদের ট্রান্সক্রিপশনাল নিয়ন্ত্রণের প্রক্রিয়াগুলো অন্বেষণ করতে উদ্যোগী হই। দুটি ডেটাসেটে UMAP দ্বারা সংজ্ঞায়িত ফাস্ট-টুইচ ও স্লো-টুইচ ফাইবার ক্লাস্টারগুলোর তুলনা করে (চিত্র ১জি–এইচ এবং ৪এ–বি), ট্রান্সক্রিপটোমিক এবং প্রোটিওমিক বিশ্লেষণে যথাক্রমে ১৩৬৬ এবং ৮০৪টি ভিন্নভাবে প্রাচুর্যপূর্ণ বৈশিষ্ট্য শনাক্ত করা হয়েছে (চিত্র ৪এ–বি, পরিপূরক ডেটাসেট ৯–১২)। আমরা সারকোমিয়ার (যেমন, ট্রপোমায়োসিন এবং ট্রপোনিন), এক্সাইটেশন-কন্ট্রাকশন কাপলিং (SERCA আইসোফর্ম) এবং শক্তি বিপাক (যেমন, ALDOA এবং CKB) সম্পর্কিত বৈশিষ্ট্যসূচক চিহ্নগুলোতে প্রত্যাশিত পার্থক্য লক্ষ্য করেছি। অধিকন্তু, প্রোটিন ইউবিকুইটিনেশন নিয়ন্ত্রণকারী ট্রান্সক্রিপ্ট এবং প্রোটিনগুলো ফাস্ট-টুইচ ও স্লো-টুইচ ফাইবারে ভিন্নভাবে প্রকাশিত হয়েছিল (যেমন, USP54, SH3RF2, USP28, এবং USP48) (চিত্র ৪এ–বি)। অধিকন্তু, মাইক্রোবিয়াল প্রোটিন জিন RP11-451G4.2 (DWORF), যা পূর্বে ভেড়ার পেশী তন্তুর প্রকারভেদে ভিন্নভাবে প্রকাশিত হতে দেখা গেছে⁴³ এবং কার্ডিয়াক পেশীতে SERCA কার্যকলাপ বৃদ্ধি করে⁴⁴, তা ধীরগতির কঙ্কাল পেশী তন্তুতে উল্লেখযোগ্যভাবে আপরেগুলেটেড হয়েছিল (চিত্র 4A)। একইভাবে, স্বতন্ত্র তন্তুর স্তরে, বিপাক-সম্পর্কিত ল্যাকটেট ডিহাইড্রোজিনেজ আইসোফর্ম (LDHA এবং LDHB, চিত্র 4C এবং পরিপূরক চিত্র 8A)⁴⁵,⁴⁶-এর মতো পরিচিত সিগনেচারগুলির পাশাপাশি পূর্বে অজানা তন্তু-প্রকার-নির্দিষ্ট সিগনেচারগুলিতে (যেমন IRX3, USP54, USP28, এবং DPYSL3) উল্লেখযোগ্য পার্থক্য পরিলক্ষিত হয়েছিল (চিত্র 4C)। ট্রান্সক্রিপ্টোমিক এবং প্রোটিওমিক ডেটাসেটগুলির মধ্যে ভিন্নভাবে প্রকাশিত বৈশিষ্ট্যগুলির একটি উল্লেখযোগ্য ওভারল্যাপ ছিল (পরিপূরক চিত্র 8B), সেইসাথে একটি ফোল্ড চেঞ্জ কোরিলেশন ছিল যা প্রধানত সারকোমিয়ার বৈশিষ্ট্যগুলির আরও সুস্পষ্ট ভিন্ন প্রকাশের দ্বারা চালিত হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 8C)। বিশেষভাবে উল্লেখ্য, কিছু সিগনেচার (যেমন USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) শুধুমাত্র প্রোটিওমিক স্তরে শক্তিশালী পোস্ট-ট্রান্সক্রিপশনাল নিয়ন্ত্রণ দেখিয়েছে এবং স্লো/ফাস্ট টুইচ ফাইবার টাইপ-নির্দিষ্ট এক্সপ্রেশন প্রোফাইল প্রদর্শন করেছে (পরিশিষ্ট চিত্র 8C)।
চিত্র 1G–H-এ ইউনিফর্ম ম্যানিফোল্ড অ্যাপ্রক্সিমেশন অ্যান্ড প্রোজেকশন (UMAP) প্লট দ্বারা চিহ্নিত ধীর এবং দ্রুত ক্লাস্টারগুলির তুলনা করে A এবং B ভলকানো প্লট। রঙিন বিন্দুগুলি সেইসব ট্রান্সক্রিপ্ট বা প্রোটিনকে প্রতিনিধিত্ব করে যেগুলি FDR < 0.05-এ উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন, এবং গাঢ় বিন্দুগুলি সেইসব ট্রান্সক্রিপ্ট বা প্রোটিনকে প্রতিনিধিত্ব করে যেগুলি লগ পরিবর্তন > 1-এ উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন। দ্বি-মুখী পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ করা হয়েছিল বেনজামিনি-হকবার্গ অ্যাডজাস্টেড পি মান সহ DESeq2 ওয়াল্ড টেস্ট (ট্রান্সক্রিপ্টোমিক্স) অথবা একাধিক তুলনার জন্য বেনজামিনি-হকবার্গ অ্যাডজাস্টমেন্ট সহ এম্পিরিক্যাল বেসিয়ান বিশ্লেষণযুক্ত লিম্মা লিনিয়ার মডেল পদ্ধতি (প্রোটিওমিক্স) ব্যবহার করে। C ধীর এবং দ্রুত ফাইবারের মধ্যে নির্বাচিত ভিন্নভাবে প্রকাশিত জিন বা প্রোটিনের সিগনেচার প্লট। D উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্নভাবে প্রকাশিত ট্রান্সক্রিপ্ট এবং প্রোটিনের এনরিচমেন্ট বিশ্লেষণ। ওভারল্যাপিং মানগুলো উভয় ডেটাসেটেই সমৃদ্ধ, ট্রান্সক্রিপ্টোম মানগুলো শুধুমাত্র ট্রান্সক্রিপ্টোমে সমৃদ্ধ, এবং প্রোটিওম মানগুলো শুধুমাত্র প্রোটিওমে সমৃদ্ধ। বেনজামিনি-হকবার্গ অ্যাডজাস্টেড পি-ভ্যালু ব্যবহার করে ক্লাস্টারপ্রোফাইলার প্যাকেজের মাধ্যমে পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ই. SCENIC-থেকে প্রাপ্ত রেগুলেটর স্পেসিফিসিটি স্কোর এবং ফাইবারের প্রকারভেদের মধ্যে ডিফারেনশিয়াল mRNA এক্সপ্রেশনের উপর ভিত্তি করে SCENIC দ্বারা চিহ্নিত ফাইবারের প্রকারভেদ-নির্দিষ্ট ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরসমূহ। এফ. ধীর এবং দ্রুত ফাইবারের মধ্যে ডিফারেনশিয়ালি এক্সপ্রেসড নির্বাচিত ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরগুলোর প্রোফাইলিং।
এরপর আমরা ভিন্নভাবে উপস্থাপিত জিন এবং প্রোটিনের একটি ওভাররিপ্রেজেন্টেশন বিশ্লেষণ করেছি (চিত্র 4D, পরিপূরক ডেটা সেট 13)। দুটি ডেটাসেটের মধ্যে ভিন্ন বৈশিষ্ট্যগুলির জন্য পাথওয়ে এনরিচমেন্ট প্রত্যাশিত পার্থক্য প্রকাশ করেছে, যেমন ফ্যাটি অ্যাসিড β-অক্সিডেশন এবং কিটোন বিপাক প্রক্রিয়া (ধীর ফাইবার), মায়োফাইলামেন্ট/পেশী সংকোচন (যথাক্রমে দ্রুত এবং ধীর ফাইবার), এবং কার্বোহাইড্রেট ক্যাটাবলিক প্রক্রিয়া (দ্রুত ফাইবার)। দ্রুত ফাইবারে সেরিন/থ্রিওনিন প্রোটিন ফসফাটেজ কার্যকলাপও বৃদ্ধি পেয়েছিল, যা নিয়ন্ত্রক এবং অনুঘটক ফসফাটেজ সাবইউনিট (PPP3CB, PPP1R3D, এবং PPP1R3A) এর মতো বৈশিষ্ট্য দ্বারা চালিত, যা গ্লাইকোজেন বিপাক নিয়ন্ত্রণ করে বলে পরিচিত (47) (পরিপূরক চিত্র 8D–E)। দ্রুত ফাইবারে সমৃদ্ধ অন্যান্য পাথওয়েগুলির মধ্যে প্রোটিওমে প্রসেসিং (P-) বডি (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (পরিপূরক চিত্র 8F) অন্তর্ভুক্ত ছিল, যা সম্ভবত পোস্ট-ট্রান্সক্রিপশনাল রেগুলেশনের (48) সাথে জড়িত, এবং ট্রান্সক্রিপ্টোমে ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর অ্যাক্টিভিটি (SREBF1, RXRG, RORA) (পরিপূরক চিত্র 8G)। ধীর ফাইবারগুলি অক্সিডোরেডাক্টেজ অ্যাক্টিভিটি (BDH1, DCXR, TXN2) (পরিপূরক চিত্র 8H), অ্যামাইড বাইন্ডিং (CPTP, PFDN2, CRYAB) (পরিপূরক চিত্র 8I), এক্সট্রাসেলুলার ম্যাট্রিক্স (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (পরিপূরক চিত্র 8J), এবং রিসেপ্টর-লিগ্যান্ড অ্যাক্টিভিটি (FNDC5, SPX, NENF) (পরিপূরক চিত্র 8K)-তে সমৃদ্ধ ছিল।
ধীর/দ্রুত পেশী তন্তুর প্রকারভেদের বৈশিষ্ট্যের অন্তর্নিহিত ট্রান্সক্রিপশনাল নিয়ন্ত্রণ সম্পর্কে আরও অন্তর্দৃষ্টি লাভের জন্য, আমরা SCENIC49 (পরিপূরক ডেটা সেট 14) ব্যবহার করে ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর এনরিচমেন্ট বিশ্লেষণ করেছি। দ্রুত এবং ধীর পেশী তন্তুর মধ্যে অনেক ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ ছিল (চিত্র 4E)। এর মধ্যে MAFA-এর মতো ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর অন্তর্ভুক্ত ছিল, যা পূর্বে দ্রুত পেশী তন্তুর বিকাশের সাথে যুক্ত ছিল,50 এবং সেইসাথে এমন বেশ কিছু ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরও ছিল যা পূর্বে পেশী তন্তুর প্রকারভেদ-নির্দিষ্ট জিন প্রোগ্রামের সাথে যুক্ত ছিল না। এদের মধ্যে, PITX1, EGR1, এবং MYF6 ছিল দ্রুত পেশী তন্তুতে সবচেয়ে বেশি সমৃদ্ধ ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর (চিত্র 4E)। বিপরীতে, ZSCAN30 এবং EPAS1 (HIF2A নামেও পরিচিত) ছিল ধীর পেশী তন্তুতে সবচেয়ে বেশি সমৃদ্ধ ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর (চিত্র 4E)। এর সাথে সামঞ্জস্য রেখে, দ্রুত পেশী তন্তুর সাথে সম্পর্কিত UMAP অঞ্চলে MAFA উচ্চ মাত্রায় প্রকাশিত হয়েছিল, যেখানে EPAS1-এর প্রকাশের ধরণ ছিল বিপরীত (চিত্র 4F)।
পরিচিত প্রোটিন-কোডিং জিন ছাড়াও, অসংখ্য নন-কোডিং আরএনএ বায়োটাইপ রয়েছে যা মানব বিকাশ এবং রোগের নিয়ন্ত্রণে জড়িত থাকতে পারে। ৫১, ৫২ ট্রান্সক্রিপ্টোম ডেটাসেটে, বেশ কিছু নন-কোডিং আরএনএ ফাইবার টাইপ স্পেসিফিসিটি প্রদর্শন করে (চিত্র ৫এ এবং সাপ্লিমেন্টারি ডেটাসেট ১৫), যার মধ্যে রয়েছে LINC01405, যা স্লো ফাইবারের জন্য অত্যন্ত নির্দিষ্ট এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল মায়োপ্যাথি রোগীদের পেশীতে এর পরিমাণ হ্রাস পায় বলে জানা গেছে। ৫৩ এর বিপরীতে, RP11-255P5.3, যা lnc-ERCC5-5 জিনের (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) ৫৪ অনুরূপ, ফাস্ট ফাইবার টাইপ স্পেসিফিসিটি প্রদর্শন করে। LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) এবং RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) উভয়ই কঙ্কাল পেশীর প্রতি নির্দিষ্টতা প্রদর্শন করে (পরিপূরক চিত্র 9A–B) এবং তাদের 1 Mb জিনোমিক প্রতিবেশের মধ্যে কোনো পরিচিত সংকোচনশীল জিন নেই, যা থেকে বোঝা যায় যে তারা পার্শ্ববর্তী সংকোচনশীল জিন নিয়ন্ত্রণের পরিবর্তে ফাইবারের প্রকারভেদ নিয়ন্ত্রণে একটি বিশেষ ভূমিকা পালন করে। যথাক্রমে LINC01405 এবং RP11-255P5.3-এর ধীর/দ্রুত ফাইবারের প্রকারভেদ-নির্দিষ্ট এক্সপ্রেশন প্রোফাইল RNAscope ব্যবহার করে নিশ্চিত করা হয়েছিল (চিত্র 5B–C)।
A. ধীর- এবং দ্রুত-সংকোচনশীল পেশী তন্তুতে নন-কোডিং আরএনএ ট্রান্সক্রিপ্টগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে নিয়ন্ত্রিত হয়। B. প্রতিনিধিত্বমূলক আরএনএস্কোপ চিত্র যা যথাক্রমে LINC01405 এবং RP11-255P5.3-এর ধীর- এবং দ্রুত-সংকোচনশীল তন্তুর প্রকারভেদের নির্দিষ্টতা প্রদর্শন করে। স্কেল বার = ৫০ μm। C. আরএনএস্কোপ দ্বারা নির্ধারিত মায়োফাইবারের প্রকারভেদ-নির্দিষ্ট নন-কোডিং আরএনএ এক্সপ্রেশনের পরিমাণ নির্ধারণ (n = স্বাধীন ব্যক্তিদের থেকে নেওয়া ৩টি বায়োপসি, প্রতিটি ব্যক্তির মধ্যে দ্রুত এবং ধীর পেশী তন্তুর তুলনা করে)। একটি দ্বি-পুচ্ছ স্টুডেন্ট'স টি-টেস্ট ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। বক্স প্লটগুলি মধ্যক এবং প্রথম ও তৃতীয় কোয়ার্টাইল দেখায়, যেখানে হুইস্কারগুলি সর্বনিম্ন এবং সর্বোচ্চ মান নির্দেশ করে। D. ডি নভো মাইক্রোবিয়াল প্রোটিন শনাক্তকরণ কর্মপ্রবাহ (BioRender.com দিয়ে তৈরি)। ই. মাইক্রোবিয়াল প্রোটিন LINC01405_ORF408:17441:17358 বিশেষভাবে ধীরগতির কঙ্কাল পেশী তন্তুতে প্রকাশিত হয় (স্বাধীন অংশগ্রহণকারীদের থেকে সংগৃহীত ৫টি বায়োপসি, যেখানে প্রতিটি অংশগ্রহণকারীর দ্রুত এবং ধীরগতির পেশী তন্তুর তুলনা করা হয়েছে)। পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ করা হয়েছে লিম লিনিয়ার মডেল পদ্ধতির সাথে একটি এম্পিরিক্যাল বেসিয়ান পদ্ধতির সমন্বয়ে, এবং এরপর পি-ভ্যালু সমন্বয় সহ একাধিক তুলনার জন্য বেনজামিনি-হকবার্গ পদ্ধতি প্রয়োগ করা হয়েছে। বক্স প্লটগুলো মধ্যক, প্রথম এবং তৃতীয় কোয়ার্টাইল দেখায়, যেখানে হুইস্কারগুলো সর্বোচ্চ/সর্বনিম্ন মান নির্দেশ করে।
সম্প্রতি, গবেষণায় দেখা গেছে যে অনেক সম্ভাব্য নন-কোডিং ট্রান্সক্রিপ্ট প্রতিলিপিকৃত মাইক্রোবিয়াল প্রোটিনকে এনকোড করে, যার মধ্যে কিছু পেশীর কার্যকারিতা নিয়ন্ত্রণ করে। ৪৪, ৫৫ সম্ভাব্য ফাইবার টাইপ নির্দিষ্টতা সম্পন্ন মাইক্রোবিয়াল প্রোটিন শনাক্ত করার জন্য, আমরা আমাদের ১০০০ ফাইবার প্রোটিওম ডেটাসেটে একটি কাস্টম FASTA ফাইল ব্যবহার করে অনুসন্ধান করেছি, যেখানে ১০০০ ফাইবার ট্রান্সক্রিপ্টোম ডেটাসেটে পাওয়া নন-কোডিং ট্রান্সক্রিপ্টগুলোর (n = ৩০৫) সিকোয়েন্স রয়েছে (চিত্র ৫ডি)। আমরা ২২টি ভিন্ন ট্রান্সক্রিপ্ট থেকে ১৯৭টি মাইক্রোবিয়াল প্রোটিন শনাক্ত করেছি, যার মধ্যে ৭১টি ধীর এবং দ্রুত কঙ্কাল পেশী ফাইবারের মধ্যে ভিন্নভাবে নিয়ন্ত্রিত ছিল (পরিপূরক চিত্র ৯সি এবং পরিপূরক ডেটা সেট ১৬)। LINC01405-এর জন্য, তিনটি মাইক্রোবিয়াল প্রোটিন পণ্য শনাক্ত করা হয়েছে, যার মধ্যে একটি তার ট্রান্সক্রিপ্টের মতো ধীর ফাইবারের প্রতি একই রকম নির্দিষ্টতা দেখিয়েছে (চিত্র ৫ই এবং পরিপূরক চিত্র ৯ডি)। এইভাবে, আমরা LINC01405-কে ধীর কঙ্কাল পেশী ফাইবারের জন্য নির্দিষ্ট একটি মাইক্রোবিয়াল প্রোটিন এনকোডকারী জিন হিসাবে শনাক্ত করেছি।
আমরা স্বতন্ত্র পেশী তন্তুর বৃহৎ পরিসরে প্রোটিওমিক বৈশিষ্ট্য নিরূপণের জন্য একটি ব্যাপক কর্মপ্রবাহ তৈরি করেছি এবং সুস্থ অবস্থায় তন্তুর ভিন্নতার নিয়ন্ত্রকসমূহ শনাক্ত করেছি। নেমালাইন মায়োপ্যাথি কীভাবে কঙ্কাল পেশী তন্তুর ভিন্নতাকে প্রভাবিত করে তা বোঝার জন্য আমরা এই কর্মপ্রবাহটি প্রয়োগ করেছি। নেমালাইন মায়োপ্যাথি হলো বংশগত পেশীর রোগ যা পেশী দুর্বলতার কারণ হয় এবং আক্রান্ত শিশুদের মধ্যে শ্বাসকষ্ট, স্কোলিওসিস এবং অঙ্গ-প্রত্যঙ্গের সীমিত সঞ্চালনের মতো বিভিন্ন জটিলতা দেখা দেয়। ১৯,২০ সাধারণত, নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে, অ্যাকটিন আলফা ১ (ACTA1)-এর মতো জিনের প্যাথোজেনিক ভ্যারিয়েন্টগুলোর ফলে মায়োফাইবারের গঠনে স্লো-টুইচ ফাইবারের প্রাধান্য দেখা যায়, যদিও এই প্রভাবটি ভিন্নধর্মী। একটি উল্লেখযোগ্য ব্যতিক্রম হলো ট্রোপোনিন টি১ নেমালাইন মায়োপ্যাথি (TNNT1), যেখানে ফাস্ট ফাইবারের প্রাধান্য দেখা যায়। সুতরাং, নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে পরিলক্ষিত কঙ্কাল পেশী তন্তুর কার্যকারিতার অস্বাভাবিকতার অন্তর্নিহিত ভিন্নতা সম্পর্কে আরও ভালো ধারণা এই রোগগুলো এবং মায়োফাইবারের প্রকারের মধ্যে জটিল সম্পর্ক উন্মোচন করতে সাহায্য করতে পারে।
সুস্থ নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর (প্রতি গ্রুপে n=3) তুলনায়, ACTA1 এবং TNNT1 জিনে মিউটেশনযুক্ত নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগীদের থেকে বিচ্ছিন্ন মায়োফাইবারে উল্লেখযোগ্য মায়োফাইবারের ক্ষয় বা বিকৃতি দেখা গেছে (চিত্র 6A, পরিপূরক সারণি 3)। উপলব্ধ উপাদানের সীমিত পরিমাণের কারণে এটি প্রোটিওমিক বিশ্লেষণের জন্য উল্লেখযোগ্য প্রযুক্তিগত চ্যালেঞ্জ তৈরি করেছিল। তা সত্ত্বেও, আমরা 272টি কঙ্কালের মায়োফাইবারে 2485টি প্রোটিন সনাক্ত করতে সক্ষম হয়েছি। প্রতি ফাইবারে কমপক্ষে 1000টি পরিমাণকৃত প্রোটিন ফিল্টার করার পর, 250টি ফাইবারকে পরবর্তী বায়োইনফরমেটিক্স বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। ফিল্টার করার পর, প্রতি ফাইবারে গড়ে 1573 ± 359টি প্রোটিন পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 10A, পরিপূরক ডেটা সেট 17-18)। লক্ষণীয়ভাবে, ফাইবারের আকারে উল্লেখযোগ্য হ্রাস সত্ত্বেও, নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগীর নমুনাগুলির প্রোটিওম গভীরতা কেবল সামান্যই হ্রাস পেয়েছিল। অধিকন্তু, আমাদের নিজস্ব ফাস্টা (FASTA) ফাইল (নন-কোডিং ট্রান্সক্রিপ্ট সহ) ব্যবহার করে এই ডেটা প্রক্রিয়াকরণের মাধ্যমে আমরা নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগীদের কঙ্কাল পেশীতন্তু থেকে পাঁচটি মাইক্রোবিয়াল প্রোটিন শনাক্ত করতে সক্ষম হয়েছি (পরিপূরক ডেটা সেট ১৯)। প্রোটিওমের ডায়নামিক রেঞ্জ উল্লেখযোগ্যভাবে বিস্তৃত ছিল, এবং কন্ট্রোল গ্রুপের মোট প্রোটিনের পরিমাণ পূর্ববর্তী ১০০০-তন্তুর প্রোটিওম বিশ্লেষণের ফলাফলের সাথে ভালোভাবে সামঞ্জস্যপূর্ণ ছিল (পরিপূরক চিত্র ১০বি–সি)।
A. ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি (NM)-তে MYH-এর উপর ভিত্তি করে ফাইবারের ক্ষয় বা বিকৃতি এবং বিভিন্ন ধরণের ফাইবারের প্রাধান্য প্রদর্শনকারী আণুবীক্ষণিক চিত্র। স্কেল বার = ১০০ μm। ACTA1 এবং TNNT1 রোগীদের ক্ষেত্রে স্টেইনিং-এর পুনরাবৃত্তিযোগ্যতা নিশ্চিত করার জন্য, প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র নির্বাচন করার আগে তিনজন রোগীর বায়োপসি দুই থেকে তিনবার স্টেইন করা হয়েছিল (প্রতি ক্ষেত্রে চারটি সেকশন)। B. MYH-এর উপর ভিত্তি করে অংশগ্রহণকারীদের মধ্যে ফাইবারের প্রকারের অনুপাত। C. নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগী এবং কন্ট্রোলদের কঙ্কাল পেশীর ফাইবারের প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিস (PCA) প্লট। D. চিত্র ২-এ বিশ্লেষণ করা ১০০০টি ফাইবার থেকে নির্ধারিত একটি PCA প্লটে নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগী এবং কন্ট্রোলদের কঙ্কাল পেশীর ফাইবার প্রক্ষেপিত। উদাহরণস্বরূপ, ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি আক্রান্ত অংশগ্রহণকারী ও কন্ট্রোলদের মধ্যে এবং ACTA1 ও TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি আক্রান্ত অংশগ্রহণকারীদের নিজেদের মধ্যে পার্থক্য তুলনা করে ভলকানো প্লট। রঙিন বৃত্তগুলো π < 0.05 মানে তাৎপর্যপূর্ণভাবে ভিন্ন প্রোটিনগুলোকে নির্দেশ করে, এবং গাঢ় বিন্দুগুলো FDR < 0.05 মানে তাৎপর্যপূর্ণভাবে ভিন্ন প্রোটিনগুলোকে নির্দেশ করে। পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ লিম্মা লিনিয়ার মডেল পদ্ধতি এবং এম্পিরিক্যাল বেসিয়ান পদ্ধতি ব্যবহার করে করা হয়েছিল, এবং এরপর বেনজামিনি-হকবার্গ পদ্ধতি ব্যবহার করে একাধিক তুলনার জন্য পি-ভ্যালু সমন্বয় করা হয়েছিল। এইচ. সম্পূর্ণ প্রোটিওম জুড়ে এবং টাইপ ১ ও ২এ ফাইবারে তাৎপর্যপূর্ণভাবে ভিন্নভাবে প্রকাশিত প্রোটিনের এনরিচমেন্ট বিশ্লেষণ। পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ ক্লাস্টারপ্রোফাইলার প্যাকেজ এবং বেনজামিনি-হকবার্গ সমন্বয়কৃত পি-ভ্যালু ব্যবহার করে করা হয়েছিল। আই, জে. এক্সট্রাসেলুলার ম্যাট্রিক্স এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল জিন অনটোলজি (GO) টার্ম দ্বারা রঙিন প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিস (PCA) প্লট।
যেহেতু নেমালাইন মায়োপ্যাথি কঙ্কাল পেশীতে MYH-প্রকাশকারী মায়োফাইবারের প্রকারের অনুপাতকে প্রভাবিত করতে পারে,¹⁹,²⁰ তাই আমরা প্রথমে নেমালাইন মায়োপ্যাথি আক্রান্ত রোগী এবং কন্ট্রোলদের মধ্যে MYH-প্রকাশকারী মায়োফাইবারের প্রকার পরীক্ষা করেছিলাম। আমরা 1000 মায়োফাইবার অ্যাসের জন্য পূর্বে বর্ণিত একটি নিরপেক্ষ পদ্ধতি ব্যবহার করে মায়োফাইবারের প্রকার নির্ধারণ করেছি (পরিপূরক চিত্র 10D–E) এবং আবারও বিশুদ্ধ 2X মায়োফাইবার সনাক্ত করতে ব্যর্থ হয়েছি (চিত্র 6B)। আমরা মায়োফাইবারের প্রকারের উপর নেমালাইন মায়োপ্যাথির একটি ভিন্নধর্মী প্রভাব লক্ষ্য করেছি, কারণ ACTA1 মিউটেশনযুক্ত দুজন রোগীর ক্ষেত্রে টাইপ 1 মায়োফাইবারের অনুপাত বৃদ্ধি পেয়েছিল, যেখানে TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিযুক্ত দুজন রোগীর ক্ষেত্রে টাইপ 1 মায়োফাইবারের অনুপাত হ্রাস পেয়েছিল (চিত্র 6B)। প্রকৃতপক্ষে, ACTA1-নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে MYH2 এবং ফাস্ট ট্রোপোনিন আইসোফর্ম (TNNC2, TNNI2, এবং TNNT3)-এর এক্সপ্রেশন হ্রাস পেয়েছিল, যেখানে TNNT1-নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে MYH7-এর এক্সপ্রেশন হ্রাস পেয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 11A)। এটি নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে হেটেরোজেনাস মায়োফাইবার টাইপ সুইচিং-এর পূর্ববর্তী প্রতিবেদনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ।19,20 আমরা ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রির মাধ্যমে এই ফলাফলগুলি নিশ্চিত করেছি এবং দেখেছি যে ACTA1-নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে আক্রান্ত রোগীদের টাইপ 1 মায়োফাইবারের প্রাধান্য ছিল, যেখানে TNNT1-নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে আক্রান্ত রোগীদের ক্ষেত্রে এর বিপরীত প্যাটার্ন দেখা গেছে (চিত্র 6A)।
একক-ফাইবার প্রোটিওম স্তরে, ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগীদের কঙ্কাল পেশীর ফাইবারগুলো অধিকাংশ কন্ট্রোল ফাইবারের সাথে গুচ্ছবদ্ধ হয়েছিল, যেখানে TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি ফাইবারগুলো সাধারণত সবচেয়ে গুরুতরভাবে ক্ষতিগ্রস্ত ছিল (চিত্র 6C)। প্রতিটি রোগীর জন্য ছদ্ম-স্ফীত ফাইবারের প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট অ্যানালাইসিস (PCA) প্লট অঙ্কন করার সময় এটি বিশেষভাবে স্পষ্ট হয়েছিল, যেখানে TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগী ২ এবং ৩ কন্ট্রোল নমুনাগুলো থেকে সবচেয়ে দূরে অবস্থান করছিল (পরিপূরক চিত্র 11B, পরিপূরক ডেটা সেট 20)। মায়োপ্যাথি রোগীদের ফাইবারগুলো সুস্থ ফাইবারের সাথে কীভাবে তুলনীয় তা আরও ভালোভাবে বোঝার জন্য, আমরা সুস্থ প্রাপ্তবয়স্ক অংশগ্রহণকারীদের ১,০০০ ফাইবারের প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ থেকে প্রাপ্ত বিস্তারিত তথ্য ব্যবহার করেছি। আমরা মায়োপ্যাথি ডেটাসেটের (ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগী এবং কন্ট্রোল) ফাইবারগুলোকে ১০০০-ফাইবারের প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ থেকে প্রাপ্ত PCA প্লটের উপর প্রক্ষেপণ করেছি (চিত্র 6D)। কন্ট্রোল ফাইবারগুলিতে PC2 বরাবর MYH ফাইবার টাইপের বিন্যাস ১০০০-ফাইবার প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ থেকে প্রাপ্ত ফাইবার বিন্যাসের অনুরূপ ছিল। তবে, নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগীদের বেশিরভাগ ফাইবার তাদের নিজস্ব MYH ফাইবার টাইপ নির্বিশেষে PC2 বরাবর নিচের দিকে সরে গিয়ে সুস্থ ফাস্ট-টুইচ ফাইবারের সাথে ওভারল্যাপ করে। সুতরাং, যদিও MYH-ভিত্তিক পদ্ধতি ব্যবহার করে পরিমাণ নির্ণয় করার সময় ACTA1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগীদের ক্ষেত্রে টাইপ ১ ফাইবারের দিকে একটি পরিবর্তন দেখা গিয়েছিল, ACTA1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি উভয়ই কঙ্কাল পেশীর ফাইবার প্রোটিওমকে ফাস্ট-টুইচ ফাইবারের দিকে স্থানান্তরিত করেছে।
এরপর আমরা প্রতিটি রোগীর দলকে সরাসরি সুস্থ নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর সাথে তুলনা করি এবং ACTA1 ও TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে যথাক্রমে ২৫৬ এবং ৫৫২টি ভিন্নভাবে প্রকাশিত প্রোটিন শনাক্ত করি (চিত্র ৬ই–ছ এবং পরিপূরক চিত্র ১১গ, পরিপূরক ডেটা সেট ২১)। জিন এনরিচমেন্ট বিশ্লেষণে মাইটোকন্ড্রিয়াল প্রোটিনের একটি সমন্বিত হ্রাস প্রকাশ পেয়েছে (চিত্র ৬জ–ঝ, পরিপূরক ডেটা সেট ২২)। আশ্চর্যজনকভাবে, ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে ফাইবারের প্রকারভেদের ভিন্ন প্রাধান্য থাকা সত্ত্বেও, এই হ্রাস MYH-ভিত্তিক ফাইবারের প্রকারভেদের উপর সম্পূর্ণ স্বাধীন ছিল (চিত্র ৬জ এবং পরিপূরক চিত্র ১১ঘ–ঝ, পরিপূরক ডেটা সেট ২৩)। ACTA1 বা TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে তিনটি মাইক্রোবিয়াল প্রোটিনও নিয়ন্ত্রিত হয়েছিল। এই মাইক্রোপ্রোটিনগুলির মধ্যে দুটি, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (যা LINC00598 বা Lnc-FOXO1 নামেও পরিচিত) এবং ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), শুধুমাত্র টাইপ 1 মায়োফাইবারে ভিন্ন প্রাচুর্য দেখিয়েছে। ENSG00000215483_TR14_ORF67 পূর্বে কোষ চক্র নিয়ন্ত্রণে ভূমিকা পালন করে বলে জানা গেছে। 56 অন্যদিকে, সুস্থ নিয়ন্ত্রণের তুলনায় ACTA1-নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে ENSG00000232046_TR1_ORF437 (যা LINC01798-এর অনুরূপ) টাইপ 1 এবং টাইপ 2A উভয় মায়োফাইবারেই বৃদ্ধি পেয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 12A, পরিপূরক ডেটা সেট 24)। এর বিপরীতে, নেমালাইন মায়োপ্যাথি দ্বারা রাইবোসোমাল প্রোটিনগুলি মূলত অপ্রভাবিত ছিল, যদিও ACTA1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে RPS17 নিম্ন-নিয়ন্ত্রিত ছিল (চিত্র 6E)।
এনরিচমেন্ট বিশ্লেষণ ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে রোগ প্রতিরোধ ব্যবস্থার প্রক্রিয়াগুলির আপরেগুলেশনও প্রকাশ করেছে, যেখানে TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে কোষের আনুগত্যও বৃদ্ধি পেয়েছিল (চিত্র 6H)। এই এক্সট্রাসেলুলার ফ্যাক্টরগুলির এনরিচমেন্ট PC1 এবং PC2-তে এক্সট্রাসেলুলার ম্যাট্রিক্স প্রোটিন দ্বারা PCA-কে নেতিবাচক দিকে (অর্থাৎ, সবচেয়ে বেশি ক্ষতিগ্রস্ত ফাইবারের দিকে) স্থানান্তরিত করার মাধ্যমে প্রতিফলিত হয়েছিল (চিত্র 6J)। উভয় রোগীর গ্রুপেই রোগ প্রতিরোধ প্রতিক্রিয়া এবং সারকোলেম্মাল মেরামত প্রক্রিয়ার সাথে জড়িত এক্সট্রাসেলুলার প্রোটিন, যেমন অ্যানেক্সিন (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 এবং তাদের মিথস্ক্রিয়াকারী প্রোটিন S100A1159-এর বর্ধিত প্রকাশ দেখা গেছে (পরিপূরক চিত্র 12B–C)। এই প্রক্রিয়াটি পূর্বে মাসকুলার ডিস্ট্রফিতে বর্ধিত বলে রিপোর্ট করা হয়েছে60 কিন্তু, আমাদের জ্ঞান অনুসারে, এটি পূর্বে নেমালাইন মায়োপ্যাথির সাথে যুক্ত করা হয়নি। আঘাতের পর সারকোলেম্মার মেরামতের জন্য এবং নবগঠিত মায়োসাইটগুলির মায়োফাইবারের সাথে সংযুক্তির জন্য এই আণবিক যন্ত্রপাতির স্বাভাবিক কার্যকারিতা প্রয়োজন58,61। সুতরাং, উভয় রোগীর গ্রুপে এই প্রক্রিয়ার বর্ধিত কার্যকলাপ মায়োফাইবারের অস্থিতিশীলতার কারণে সৃষ্ট আঘাতের প্রতি একটি নিরাময়মূলক প্রতিক্রিয়া নির্দেশ করে।
প্রতিটি নেমালাইন মায়োপ্যাথির প্রভাবগুলো ভালোভাবে সম্পর্কযুক্ত ছিল (r = 0.736) এবং যুক্তিসঙ্গত ওভারল্যাপ দেখিয়েছে (পরিপূরক চিত্র 11A–B), যা নির্দেশ করে যে ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথির প্রোটিওমের উপর একই রকম প্রভাব রয়েছে। তবে, কিছু প্রোটিন শুধুমাত্র ACTA1 বা TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে নিয়ন্ত্রিত হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 11A এবং C)। প্রোফাইব্রোটিক প্রোটিন MFAP4 ছিল TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে সবচেয়ে বেশি আপরেগুলেটেড প্রোটিনগুলোর মধ্যে একটি, কিন্তু ACTA1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে এটি অপরিবর্তিত ছিল। SKIC8, যা HOX জিনের ট্রান্সক্রিপশন নিয়ন্ত্রণের জন্য দায়ী PAF1C কমপ্লেক্সের একটি উপাদান, TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে ডাউনরেগুলেটেড হয়েছিল কিন্তু ACTA1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে প্রভাবিত হয়নি (পরিপূরক চিত্র 11A)। ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথির সরাসরি তুলনার ফলে দেখা গেছে যে, TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে মাইটোকন্ড্রিয়াল প্রোটিনের পরিমাণ বেশি হ্রাস পায় এবং ইমিউন সিস্টেম প্রোটিনের পরিমাণ বৃদ্ধি পায় (চিত্র 6G–H এবং পরিপূরক চিত্র 11C এবং 11H–I)। এই তথ্য ACTA1 নেমালাইন মায়োপ্যাথির তুলনায় ACTA1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে পরিলক্ষিত অধিক অ্যাট্রোফি/ডিস্ট্রোফির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ (চিত্র 6A), যা থেকে বোঝা যায় যে TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি এই রোগের একটি অধিক গুরুতর রূপ।
নেমালাইন মায়োপ্যাথির পর্যবেক্ষণকৃত প্রভাবগুলো সম্পূর্ণ পেশী স্তরেও বিদ্যমান থাকে কিনা তা মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগীদের একই দল থেকে সংগৃহীত পেশী বায়োপসির একটি সামগ্রিক প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ করেছি এবং সেগুলোকে কন্ট্রোল গ্রুপের (প্রতি গ্রুপে n=3) সাথে তুলনা করেছি (পরিপূরক চিত্র 13A, পরিপূরক ডেটা সেট 25)। প্রত্যাশিতভাবেই, প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট বিশ্লেষণে কন্ট্রোল গ্রুপটি ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত ছিল, যেখানে TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগীদের মধ্যে নমুনার মধ্যে উচ্চতর পরিবর্তনশীলতা দেখা গেছে, যা একক ফাইবার বিশ্লেষণে দেখা পরিবর্তনশীলতার অনুরূপ ছিল (পরিপূরক চিত্র 13B)। সামগ্রিক বিশ্লেষণটি পৃথক ফাইবারগুলোর তুলনার মাধ্যমে উদ্ঘাটিত ভিন্নভাবে প্রকাশিত প্রোটিন (পরিপূরক চিত্র 13C, পরিপূরক ডেটা সেট 26) এবং জৈবিক প্রক্রিয়াগুলোকে (পরিপূরক চিত্র 13D, পরিপূরক ডেটা সেট 27) পুনরুৎপাদন করেছে, কিন্তু এটি বিভিন্ন ধরণের ফাইবারের মধ্যে পার্থক্য করার ক্ষমতা হারিয়েছে এবং ফাইবারজুড়ে রোগের অসম প্রভাব ব্যাখ্যা করতে ব্যর্থ হয়েছে।
সামগ্রিকভাবে, এই তথ্যগুলো প্রমাণ করে যে একক-মায়োফাইবারের প্রোটিওমিক্স এমন সব ক্লিনিক্যাল জৈবিক বৈশিষ্ট্য উদ্ঘাটন করতে পারে, যা ইমিউনোব্লটিং-এর মতো টার্গেটেড পদ্ধতির মাধ্যমে শনাক্ত করা যায় না। অধিকন্তু, এই তথ্যগুলো ফিনোটাইপিক অভিযোজন বর্ণনা করার জন্য শুধুমাত্র অ্যাকটিন ফাইবার টাইপিং (MYH) ব্যবহারের সীমাবদ্ধতা তুলে ধরে। প্রকৃতপক্ষে, যদিও অ্যাকটিন এবং ট্রোপোনিন নেমালাইন মায়োপ্যাথির মধ্যে ফাইবার টাইপ পরিবর্তন ভিন্ন হয়, উভয় নেমালাইন মায়োপ্যাথিই MYH ফাইবার টাইপিংকে কঙ্কাল পেশীর ফাইবারের বিপাক থেকে বিচ্ছিন্ন করে একটি দ্রুততর এবং কম জারণধর্মী পেশী প্রোটিওমের দিকে চালিত করে।
টিস্যুগুলোর বিভিন্ন চাহিদা মেটানোর জন্য কোষীয় ভিন্নতা অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। কঙ্কাল পেশীর ক্ষেত্রে, এটিকে প্রায়শই বিভিন্ন মাত্রার বল উৎপাদন এবং ক্লান্তিযোগ্যতা দ্বারা চিহ্নিত ফাইবার টাইপ হিসাবে বর্ণনা করা হয়। তবে, এটা স্পষ্ট যে এটি কঙ্কাল পেশী ফাইবারের পরিবর্তনশীলতার একটি ক্ষুদ্র অংশই কেবল ব্যাখ্যা করে, যা পূর্বের ধারণার চেয়ে অনেক বেশি পরিবর্তনশীল, জটিল এবং বহুমুখী। প্রযুক্তিগত অগ্রগতি এখন কঙ্কাল পেশী ফাইবার নিয়ন্ত্রণকারী উপাদানগুলোর উপর আলোকপাত করেছে। প্রকৃতপক্ষে, আমাদের তথ্য থেকে বোঝা যায় যে টাইপ 2X ফাইবারগুলো কঙ্কাল পেশী ফাইবারের একটি স্বতন্ত্র উপপ্রকার নাও হতে পারে। অধিকন্তু, আমরা মেটাবলিক প্রোটিন, রাইবোসোমাল প্রোটিন এবং কোষ-সংশ্লিষ্ট প্রোটিনকে কঙ্কাল পেশী ফাইবারের ভিন্নতার প্রধান নির্ধারক হিসাবে চিহ্নিত করেছি। নেমাটোড মায়োপ্যাথিতে আক্রান্ত রোগীর নমুনায় আমাদের প্রোটিওমিক কার্যপ্রণালী প্রয়োগ করে আমরা আরও দেখিয়েছি যে MYH-ভিত্তিক ফাইবার টাইপিং কঙ্কাল পেশীর ভিন্নতাকে সম্পূর্ণরূপে প্রতিফলিত করে না, বিশেষ করে যখন সিস্টেমটি বিঘ্নিত হয়। প্রকৃতপক্ষে, MYH-ভিত্তিক ফাইবার টাইপ নির্বিশেষে, নেমাটোড মায়োপ্যাথির ফলে দ্রুততর এবং কম জারণশীল ফাইবারের দিকে একটি পরিবর্তন ঘটে।
ঊনবিংশ শতাব্দী থেকে কঙ্কাল পেশীর তন্তুগুলোকে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়ে আসছে। সাম্প্রতিক ওমিক্স বিশ্লেষণ আমাদের বিভিন্ন MYH তন্তুর প্রকারের এক্সপ্রেশন প্রোফাইল এবং বিভিন্ন উদ্দীপকের প্রতি তাদের প্রতিক্রিয়া বুঝতে সাহায্য করেছে। এখানে যেমন বর্ণনা করা হয়েছে, ওমিক্স পদ্ধতির আরেকটি সুবিধা হলো, এটি প্রচলিত অ্যান্টিবডি-ভিত্তিক পদ্ধতির তুলনায় তন্তুর প্রকার নির্দেশক (মার্কার) পরিমাপের ক্ষেত্রে অধিক সংবেদনশীল এবং কঙ্কাল পেশীর তন্তুর প্রকার নির্ধারণের জন্য একটি (বা কয়েকটি) নির্দেশকের পরিমাপের উপর নির্ভর করে না। আমরা পরিপূরক ট্রান্সক্রিপ্টোমিক এবং প্রোটিওমিক কার্যপ্রবাহ ব্যবহার করেছি এবং মানুষের কঙ্কাল পেশীর তন্তুতে তন্তুর ভিন্নতার ট্রান্সক্রিপশনাল এবং পোস্ট-ট্রান্সক্রিপশনাল নিয়ন্ত্রণ পরীক্ষা করার জন্য ফলাফলগুলোকে একীভূত করেছি। এই কার্যপ্রবাহের ফলে আমাদের সুস্থ তরুণ পুরুষদের দলে থাকা ভ্যাস্টাস ল্যাটেরালিস পেশীতে প্রোটিন পর্যায়ে বিশুদ্ধ 2X-টাইপ তন্তু শনাক্ত করা সম্ভব হয়নি। এটি পূর্ববর্তী একক তন্তু গবেষণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যেখানে সুস্থ ভ্যাস্টাস ল্যাটেরালিস পেশীতে <১% বিশুদ্ধ 2X তন্তু পাওয়া গিয়েছিল, যদিও ভবিষ্যতে অন্যান্য পেশীতে এটি নিশ্চিত করা প্রয়োজন। mRNA স্তরে প্রায় বিশুদ্ধ 2X ফাইবারের উপস্থিতি এবং প্রোটিন স্তরে কেবল মিশ্র 2A/2X ফাইবারের উপস্থিতির মধ্যেকার অসামঞ্জস্যটি বিভ্রান্তিকর। MYH আইসোফর্ম mRNA-এর প্রকাশ সার্কাডিয়ান নয়,৬৭ যা থেকে বোঝা যায় যে RNA স্তরে আপাতদৃষ্টিতে বিশুদ্ধ 2X ফাইবারগুলিতে MYH2-এর সূচনা সংকেত আমাদের চোখ এড়িয়ে যাওয়ার সম্ভাবনা কম। একটি সম্ভাব্য ব্যাখ্যা, যদিও তা সম্পূর্ণরূপে অনুমানমূলক, হতে পারে MYH আইসোফর্মগুলির মধ্যে প্রোটিন এবং/অথবা mRNA স্থিতিশীলতার পার্থক্য। প্রকৃতপক্ষে, কোনো দ্রুতগামী ফাইবারই কোনো MYH আইসোফর্মের জন্য ১০০% বিশুদ্ধ নয়, এবং এটিও স্পষ্ট নয় যে ৭০-৯০% পরিসরে MYH1 mRNA প্রকাশের মাত্রা প্রোটিন স্তরে MYH1 এবং MYH2-এর সমান প্রাচুর্যের কারণ হবে কিনা। তবে, সম্পূর্ণ ট্রান্সক্রিপ্টোম বা প্রোটিওম বিবেচনা করলে, ক্লাস্টার বিশ্লেষণ তাদের সঠিক MYH গঠন নির্বিশেষে, ধীর এবং দ্রুত কঙ্কাল পেশী ফাইবারের প্রতিনিধিত্বকারী কেবল দুটি স্বতন্ত্র ক্লাস্টারকে আত্মবিশ্বাসের সাথে শনাক্ত করতে পারে। এটি একক-নিউক্লিয়াস ট্রান্সক্রিপ্টোমিক পদ্ধতি ব্যবহার করে করা বিশ্লেষণের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যা সাধারণত কেবল দুটি স্বতন্ত্র মায়োনিউক্লিয়ার ক্লাস্টার শনাক্ত করে। ৬৮, ৬৯, ৭০ অধিকন্তু, যদিও পূর্ববর্তী প্রোটিওমিক গবেষণায় টাইপ 2X ফাইবার শনাক্ত করা হয়েছে, এই ফাইবারগুলি বাকি দ্রুত ফাইবারগুলি থেকে আলাদাভাবে গুচ্ছবদ্ধ হয় না এবং MYH-এর উপর ভিত্তি করে অন্যান্য ফাইবার প্রকারের তুলনায় কেবল অল্প সংখ্যক ভিন্নভাবে প্রাচুর্যপূর্ণ প্রোটিন দেখায়। ১৪ এই ফলাফলগুলি থেকে বোঝা যায় যে আমাদের পেশী ফাইবার শ্রেণিবিন্যাসের বিংশ শতাব্দীর প্রথম দিকের দৃষ্টিভঙ্গিতে ফিরে যাওয়া উচিত, যা মানুষের কঙ্কাল পেশী ফাইবারগুলিকে MYH-এর উপর ভিত্তি করে তিনটি স্বতন্ত্র শ্রেণিতে নয়, বরং তাদের বিপাকীয় এবং সংকোচনশীল বৈশিষ্ট্যের উপর ভিত্তি করে দুটি গুচ্ছে বিভক্ত করেছিল। ৬৩
আরও গুরুত্বপূর্ণভাবে, মায়োফাইবারের ভিন্নতাকে একাধিক মাত্রায় বিবেচনা করা উচিত। পূর্ববর্তী "ওমিক্স" গবেষণাগুলি এই দিকেই ইঙ্গিত করেছে, যা থেকে বোঝা যায় যে কঙ্কাল পেশীর ফাইবারগুলি বিচ্ছিন্ন গুচ্ছ গঠন করে না, বরং একটি অবিচ্ছিন্ন ধারা বরাবর বিন্যস্ত থাকে। 11, 13, 14, 64, 71 এখানে, আমরা দেখাচ্ছি যে, কঙ্কাল পেশীর সংকোচনশীল এবং বিপাকীয় বৈশিষ্ট্যের পার্থক্য ছাড়াও, মায়োফাইবারগুলিকে কোষ-কোষ মিথস্ক্রিয়া এবং ট্রান্সলেশন পদ্ধতির সাথে সম্পর্কিত বৈশিষ্ট্য দ্বারা পৃথক করা যেতে পারে। প্রকৃতপক্ষে, আমরা কঙ্কাল পেশীর ফাইবারগুলিতে রাইবোসোমের ভিন্নতা খুঁজে পেয়েছি যা ধীর এবং দ্রুত ফাইবারের প্রকারভেদ নির্বিশেষে ভিন্নতায় অবদান রাখে। ধীর এবং দ্রুত ফাইবারের প্রকারভেদ নির্বিশেষে এই উল্লেখযোগ্য মায়োফাইবারের ভিন্নতার অন্তর্নিহিত কারণ এখনও অস্পষ্ট, তবে এটি পেশী ফ্যাসিকলের মধ্যে বিশেষায়িত স্থানিক বিন্যাসের দিকে ইঙ্গিত করতে পারে যা নির্দিষ্ট বল এবং ভারের প্রতি সর্বোত্তমভাবে সাড়া দেয়,72 পেশীর মাইক্রোএনভায়রনমেন্টে অন্যান্য কোষের সাথে বিশেষায়িত কোষীয় বা অঙ্গ-নির্দিষ্ট যোগাযোগ73,74,75 অথবা স্বতন্ত্র মায়োফাইবারের মধ্যে রাইবোসোম কার্যকলাপের পার্থক্যের দিকেও ইঙ্গিত করতে পারে। প্রকৃতপক্ষে, রাইবোসোমাল হেটেরোপ্লাজমি, যা RPL3 এবং RPL3L-এর প্যারালোগাস প্রতিস্থাপনের মাধ্যমে অথবা rRNA-এর 2′O-মিথাইলেশন পর্যায়ে ঘটে, তা কঙ্কাল পেশীর হাইপারট্রফির সাথে সম্পর্কিত বলে দেখানো হয়েছে76,77। মাল্টি-ওমিক এবং স্থানিক প্রয়োগ, স্বতন্ত্র মায়োফাইবারের কার্যকরী বৈশিষ্ট্য নির্ধারণের সাথে মিলিত হয়ে, মাল্টি-ওমিক স্তরে পেশী জীববিজ্ঞান সম্পর্কে আমাদের বোঝাপড়াকে আরও উন্নত করবে78।
নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে আক্রান্ত রোগীদের একক মায়োফাইবারের প্রোটিওম বিশ্লেষণ করে, আমরা কঙ্কাল পেশীর ক্লিনিক্যাল প্যাথোফিজিওলজি ব্যাখ্যা করার জন্য একক মায়োফাইবার প্রোটিওমিক্সের উপযোগিতা, কার্যকারিতা এবং প্রয়োগযোগ্যতাও প্রদর্শন করেছি। অধিকন্তু, আমাদের কর্মপ্রবাহকে গ্লোবাল প্রোটিওমিক বিশ্লেষণের সাথে তুলনা করে, আমরা দেখাতে সক্ষম হয়েছি যে একক মায়োফাইবার প্রোটিওমিক্স গ্লোবাল টিস্যু প্রোটিওমিক্সের মতোই গভীর তথ্য প্রদান করে এবং আন্তঃফাইবার ভিন্নতা ও মায়োফাইবারের প্রকারভেদ বিবেচনা করে এই গভীরতাকে আরও প্রসারিত করে। সুস্থ নিয়ন্ত্রণের তুলনায় ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে ফাইবার টাইপ অনুপাতের প্রত্যাশিত (যদিও পরিবর্তনশীল) পার্থক্যের পাশাপাশি, আমরা MYH-মধ্যস্থ ফাইবার টাইপ স্যুইচিং থেকে স্বাধীন জারণমূলক এবং বহিঃকোষীয় পুনর্গঠনও পর্যবেক্ষণ করেছি। TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে ফাইব্রোসিসের কথা পূর্বেও জানা গেছে।¹⁹ তবে, আমাদের বিশ্লেষণ এই আবিষ্কারের উপর ভিত্তি করে ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে আক্রান্ত রোগীদের মায়োফাইবারে সারকোলেম্মাল মেরামত প্রক্রিয়ার সাথে জড়িত অ্যানেক্সিনের মতো বহিঃকোষীয় নিঃসৃত স্ট্রেস-সম্পর্কিত প্রোটিনের বর্ধিত মাত্রাও প্রকাশ করে।⁵⁷,⁵⁸,⁵⁹ উপসংহারে বলা যায়, নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে আক্রান্ত রোগীদের মায়োফাইবারে অ্যানেক্সিনের বর্ধিত মাত্রা গুরুতরভাবে ক্ষয়প্রাপ্ত মায়োফাইবারের মেরামতের জন্য একটি কোষীয় প্রতিক্রিয়া হতে পারে।
যদিও এই গবেষণাটি এখন পর্যন্ত মানুষের উপর করা সবচেয়ে বড় একক-তন্তু সমগ্র-পেশী-ওমিক্স বিশ্লেষণ, তবুও এর কিছু সীমাবদ্ধতা রয়েছে। আমরা তুলনামূলকভাবে ছোট এবং সমজাতীয় অংশগ্রহণকারীদের একটি নমুনা এবং একটি একক পেশী (ভাস্টাস ল্যাটেরালিস) থেকে কঙ্কাল পেশীর তন্তুগুলিকে আলাদা করেছি। অতএব, বিভিন্ন ধরণের পেশীতে এবং পেশী শারীরবৃত্তির চরম পর্যায়ে নির্দিষ্ট তন্তু গোষ্ঠীর অস্তিত্বকে বাদ দেওয়া অসম্ভব। উদাহরণস্বরূপ, আমরা এই সম্ভাবনাকে বাদ দিতে পারি না যে অতি-দ্রুত তন্তুর একটি উপসেট (যেমন, বিশুদ্ধ 2X তন্তু) অত্যন্ত প্রশিক্ষিত স্প্রিন্টার এবং/অথবা শক্তি ক্রীড়াবিদদের মধ্যে79 অথবা পেশীর নিষ্ক্রিয়তার সময়কালে66,80 উদ্ভূত হতে পারে। অধিকন্তু, অংশগ্রহণকারীদের সীমিত নমুনা আকার আমাদেরকে তন্তুর ভিন্নতার ক্ষেত্রে লিঙ্গগত পার্থক্য তদন্ত করতে বাধা দিয়েছে, কারণ পুরুষ এবং মহিলাদের মধ্যে তন্তুর প্রকারের অনুপাত ভিন্ন বলে জানা যায়। এছাড়াও, আমরা একই পেশী তন্তু বা একই অংশগ্রহণকারীদের নমুনাগুলির উপর ট্রান্সক্রিপ্টোমিক এবং প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ পরিচালনা করতে পারিনি। যেহেতু আমরা এবং অন্যান্যরা ওমিক্স বিশ্লেষণ ব্যবহার করে অতি-স্বল্প নমুনা ব্যবহারের মাধ্যমে একক-কোষ এবং একক-পেশীতন্তুর বিশ্লেষণকে উন্নত করে চলেছি (যেমনটি এখানে মাইটোকন্ড্রিয়াল মায়োপ্যাথিতে আক্রান্ত রোগীদের তন্তুর বিশ্লেষণে দেখানো হয়েছে), তাই একক পেশীতন্তুর মধ্যেই বহু-ওমিক্স (এবং কার্যকরী) পদ্ধতিগুলিকে একত্রিত করার সুযোগটি স্পষ্ট হয়ে ওঠে।
সামগ্রিকভাবে, আমাদের উপাত্ত কঙ্কাল পেশীর ভিন্নতার ট্রান্সক্রিপশনাল এবং পোস্ট-ট্রান্সক্রিপশনাল চালকসমূহকে শনাক্ত ও ব্যাখ্যা করে। বিশেষত, আমরা এমন উপাত্ত উপস্থাপন করছি যা ফাইবার টাইপের চিরায়ত MYH-ভিত্তিক সংজ্ঞার সাথে যুক্ত কঙ্কাল পেশী শারীরবিদ্যার একটি দীর্ঘস্থায়ী মতবাদকে চ্যালেঞ্জ করে। আমরা এই বিতর্ককে পুনরুজ্জীবিত করতে এবং পরিশেষে কঙ্কাল পেশী ফাইবারের শ্রেণিবিন্যাস ও ভিন্নতা সম্পর্কে আমাদের বোঝাপড়াকে পুনর্বিবেচনা করতে আশা করি।
চৌদ্দজন ককেশীয় অংশগ্রহণকারী (১২ জন পুরুষ এবং ২ জন মহিলা) স্বেচ্ছায় এই গবেষণায় অংশ নিতে সম্মত হন। গবেষণাটি ঘেন্ট ইউনিভার্সিটি হাসপাতালের এথিক্স কমিটি (BC-10237) দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল, ২০১৩ সালের হেলসিঙ্কি ঘোষণা মেনে চলেছিল এবং ClinicalTrials.gov-এ (NCT05131555) নিবন্ধিত হয়েছিল। অংশগ্রহণকারীদের সাধারণ বৈশিষ্ট্য পরিশিষ্ট সারণি ১-এ উপস্থাপন করা হয়েছে। মৌখিক এবং লিখিত অবহিত সম্মতি পাওয়ার পর, গবেষণায় চূড়ান্তভাবে অন্তর্ভুক্ত করার আগে অংশগ্রহণকারীদের একটি চিকিৎসা পরীক্ষা করা হয়েছিল। অংশগ্রহণকারীরা ছিলেন তরুণ (২২-৪২ বছর), সুস্থ (কোনো শারীরিক অসুস্থতা নেই, ধূমপানের ইতিহাস নেই) এবং মাঝারিভাবে শারীরিকভাবে সক্রিয়। পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে শারীরিক সক্ষমতা মূল্যায়নের জন্য একটি স্টেপ এরগোমিটার ব্যবহার করে সর্বাধিক অক্সিজেন গ্রহণ নির্ধারণ করা হয়েছিল। 81
বিশ্রামরত অবস্থায় এবং উপবাস অবস্থায় ১৪ দিনের ব্যবধানে তিনবার পেশীর বায়োপসি নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল। যেহেতু এই নমুনাগুলো একটি বৃহত্তর গবেষণার অংশ হিসেবে সংগ্রহ করা হয়েছিল, তাই অংশগ্রহণকারীরা বায়োপসির ৪০ মিনিট আগে প্ল্যাসিবো (ল্যাকটোজ), একটি H1-রিসেপ্টর অ্যান্টাগনিস্ট (৫৪০ মিগ্রা ফেক্সোফেনাডিন), অথবা একটি H2-রিসেপ্টর অ্যান্টাগনিস্ট (৪০ মিগ্রা ফ্যামোটিডিন) গ্রহণ করেছিলেন। আমরা পূর্বে প্রমাণ করেছি যে এই হিস্টামিন রিসেপ্টর অ্যান্টাগনিস্টগুলো বিশ্রামরত কঙ্কাল পেশীর ফিটনেসকে প্রভাবিত করে না81, এবং আমাদের কোয়ালিটি কন্ট্রোল প্লটগুলোতে (পরিপূরক চিত্র ৩ এবং ৬) কোনো অবস্থা-সম্পর্কিত ক্লাস্টারিং পরিলক্ষিত হয়নি। প্রতিটি পরীক্ষামূলক দিনের ৪৮ ঘন্টা আগে থেকে একটি প্রমিত খাদ্যতালিকা (৪১.৪ কিলোক্যালরি/কেজি দৈহিক ওজন, ৫.১ গ্রাম/কেজি দৈহিক ওজন শর্করা, ১.৪ গ্রাম/কেজি দৈহিক ওজন প্রোটিন, এবং ১.৬ গ্রাম/কেজি দৈহিক ওজন চর্বি) বজায় রাখা হয়েছিল, এবং পরীক্ষামূলক দিনের সকালে একটি প্রমিত প্রাতঃরাশ (১.৫ গ্রাম/কেজি দৈহিক ওজন শর্করা) গ্রহণ করা হয়েছিল। স্থানীয় অ্যানেস্থেসিয়ার (এপিনেফ্রিন ছাড়া ০.৫ মিলি ১% লিডোকেইন) অধীনে, পারকিউটেনিয়াস বার্গস্ট্রম অ্যাসপিরেশন ব্যবহার করে ভ্যাস্টাস ল্যাটেরালিস পেশী থেকে পেশী বায়োপসি সংগ্রহ করা হয়েছিল।৮২ পেশীর নমুনাগুলি অবিলম্বে আরএনএলেটার-এ এমবেড করা হয়েছিল এবং ম্যানুয়াল ফাইবার ডিসেকশনের আগ পর্যন্ত (৩ দিন পর্যন্ত) ৪° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল।
সদ্য পৃথক করা মায়োফাইবারের গুচ্ছগুলোকে একটি কালচার ডিশে তাজা আরএনএলেটার (RNAlater) মিডিয়ামে স্থানান্তর করা হয়েছিল। এরপর একটি স্টেরিওমাইক্রোস্কোপ এবং সূক্ষ্ম চিমটা ব্যবহার করে প্রতিটি মায়োফাইবার হাতে করে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। প্রতিটি বায়োপসি থেকে পঁচিশটি ফাইবার বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল, এবং বায়োপসির বিভিন্ন এলাকা থেকে ফাইবার নির্বাচন করার দিকে বিশেষ মনোযোগ দেওয়া হয়েছিল। বিচ্ছিন্ন করার পর, অবাঞ্ছিত প্রোটিন এবং ডিএনএ অপসারণের জন্য প্রতিটি ফাইবারকে প্রোটিনেজ কে (proteinase K) এবং ডিএনএজ (DNase) এনজাইমযুক্ত ৩ মাইক্রোলিটার (μl) লাইসিস বাফারে (সিঙ্গেলশট সেল লাইসিস কিট, বায়ো-র‍্যাড) আলতোভাবে ডুবিয়ে দেওয়া হয়েছিল। এরপর অল্প সময়ের জন্য ভর্টেক্সিং, একটি মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজে তরলটিকে স্পিনিং এবং ঘরের তাপমাত্রায় (১০ মিনিট) ইনকিউবেশনের মাধ্যমে কোষের লাইসিস এবং প্রোটিন/ডিএনএ অপসারণ শুরু করা হয়েছিল। এরপর লাইসেটটিকে একটি থার্মাল সাইক্লারে (টি১০০, বায়ো-র‍্যাড) ৩৭° সেলসিয়াসে ৫ মিনিট, ৭৫° সেলসিয়াসে ৫ মিনিট ইনকিউবেট করা হয় এবং তারপর পরবর্তী প্রক্রিয়াকরণের জন্য অবিলম্বে -৮০° সেলসিয়াসে সংরক্ষণ করা হয়।
QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen) ব্যবহার করে ২ µl মায়োফাইবারের লাইসেট থেকে ইলুমিনা-উপযোগী পলিঅ্যাডেনাইলেটেড RNA লাইব্রেরি প্রস্তুত করা হয়েছিল। বিস্তারিত পদ্ধতি প্রস্তুতকারকের ম্যানুয়ালে পাওয়া যাবে। প্রক্রিয়াটি রিভার্স ট্রান্সক্রিপশনের মাধ্যমে ফার্স্ট-স্ট্র্যান্ড cDNA সংশ্লেষণ দিয়ে শুরু হয়, এই সময়ে নমুনাগুলোর পুলিং নিশ্চিত করতে এবং পরবর্তী প্রক্রিয়াকরণে প্রযুক্তিগত পরিবর্তনশীলতা কমাতে ইউনিক মলিকিউলার আইডেন্টিফায়ার (UMI) এবং নমুনা-নির্দিষ্ট i1 বারকোড যুক্ত করা হয়। এরপর ৯৬টি মায়োফাইবারের cDNA পুল করে ম্যাগনেটিক বিডস দিয়ে বিশুদ্ধ করা হয়, যার পরে RNA অপসারণ করা হয় এবং র‍্যান্ডম প্রাইমার ব্যবহার করে সেকেন্ড-স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষণ করা হয়। লাইব্রেরিটি ম্যাগনেটিক বিডস দিয়ে বিশুদ্ধ করা হয়, পুল-নির্দিষ্ট i5/i7 ট্যাগ যুক্ত করা হয় এবং PCR দ্বারা বিবর্ধিত করা হয়। একটি চূড়ান্ত বিশুদ্ধকরণ ধাপের মাধ্যমে ইলুমিনা-উপযোগী লাইব্রেরি তৈরি হয়। প্রতিটি লাইব্রেরি পুলের গুণমান High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500) ব্যবহার করে মূল্যায়ন করা হয়েছিল।
কিউবিট কোয়ান্টিফিকেশনের উপর ভিত্তি করে, পুলগুলোকে পরবর্তীতে সমমোলার ঘনত্বে (২ এনএম) একত্রিত করা হয়েছিল। এরপর প্রাপ্ত পুলটিকে একটি নোভা সিক ৬০০০ যন্ত্রে স্ট্যান্ডার্ড মোডে নোভা সিক এস২ রিএজেন্ট কিট (১ × ১০০ নিউক্লিওটাইড) এবং ২ এনএম লোডিং (৪% ফাইএক্স) ব্যবহার করে সিকোয়েন্স করা হয়েছিল।
আমাদের পাইপলাইনটি লেক্সোজেনের কোয়ান্টসিক পুল ডেটা অ্যানালাইসিস পাইপলাইনের (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) উপর ভিত্তি করে তৈরি। প্রথমে i7/i5 ইনডেক্সের উপর ভিত্তি করে bcl2fastq2 (v2.20.0) দিয়ে ডেটা ডিমাল্টিপ্লেক্স করা হয়েছিল। এরপর i1 স্যাম্পল বারকোডের উপর ভিত্তি করে idemux (v0.1.6) দিয়ে রিড ২ ডিমাল্টিপ্লেক্স করা হয় এবং umi_tools (v1.0.1) দিয়ে UMI সিকোয়েন্সগুলো এক্সট্র্যাক্ট করা হয়। এরপর cutadapt (v3.4) দিয়ে একাধিক রাউন্ডে রিডগুলো ট্রিম করে ছোট রিড (<২০ দৈর্ঘ্য) বা শুধুমাত্র অ্যাডাপ্টার সিকোয়েন্স দিয়ে গঠিত রিডগুলো অপসারণ করা হয়। এরপর STAR (v2.6.0c) ব্যবহার করে রিডগুলোকে মানব জিনোমের সাথে অ্যালাইন করা হয় এবং SAMtools (v1.11) দিয়ে BAM ফাইলগুলো ইনডেক্স করা হয়। umi_tools (v1.0.1) ব্যবহার করে ডুপ্লিকেট রিডগুলো অপসারণ করা হয়। সবশেষে, Subread (v2.0.3)-এর featureCounts ব্যবহার করে অ্যালাইনমেন্ট গণনা করা হয়। পাইপলাইনের বিভিন্ন মধ্যবর্তী পর্যায়ে FastQC (v0.11.9) ব্যবহার করে গুণমান নিয়ন্ত্রণ করা হয়েছিল।
পরবর্তী সমস্ত বায়োইনফরমেটিক্স প্রক্রিয়াকরণ এবং ভিজ্যুয়ালাইজেশন R (v4.2.3)-এ করা হয়েছিল, প্রধানত Seurat (v4.4.0) ওয়ার্কফ্লো ব্যবহার করে। 83 অতএব, স্বতন্ত্র UMI মান এবং মেটাডেটা ম্যাট্রিক্সগুলিকে Seurat অবজেক্টে রূপান্তরিত করা হয়েছিল। সমস্ত ফাইবারের ৩০%-এর কম প্রকাশিত জিনগুলি সরিয়ে ফেলা হয়েছিল। ১০০০ UMI মান এবং ১০০০ শনাক্তকৃত জিনের ন্যূনতম থ্রেশহোল্ডের উপর ভিত্তি করে নিম্ন-মানের নমুনাগুলি সরানো হয়েছিল। অবশেষে, ৯২৫টি ফাইবার সমস্ত গুণমান নিয়ন্ত্রণ ফিল্টারিং ধাপ অতিক্রম করেছে। Seurat SCTransform v2 পদ্ধতি ব্যবহার করে UMI মানগুলিকে স্বাভাবিক করা হয়েছিল, 84 যার মধ্যে সমস্ত ৭৪১৮টি শনাক্তকৃত বৈশিষ্ট্য অন্তর্ভুক্ত ছিল, এবং অংশগ্রহণকারীদের মধ্যেকার পার্থক্যগুলি রিগ্রেস করে বাদ দেওয়া হয়েছিল। সমস্ত প্রাসঙ্গিক মেটাডেটা পরিপূরক ডেটাসেট ২৮-এ পাওয়া যাবে।