মায়োসিন ভারী শৃঙ্খলের বাইরে মানুষের কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলির বৈচিত্র্য

nature.com দেখার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে সীমিত CSS সমর্থন রয়েছে। সর্বোত্তম অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে সর্বশেষ ব্রাউজার সংস্করণ ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্যতা মোড অক্ষম করুন)। উপরন্তু, অব্যাহত সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, এই সাইটটি স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট মুক্ত থাকবে।
কঙ্কাল পেশী হল একটি ভিন্নধর্মী টিস্যু যা মূলত মায়োফাইব্রিল দিয়ে গঠিত, যা মানুষের ক্ষেত্রে সাধারণত তিন ধরণের মধ্যে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়: একটি "ধীর" (টাইপ 1) এবং দুটি "দ্রুত" (টাইপ 2A এবং 2X)। তবে, ঐতিহ্যবাহী মায়োফাইব্রিল ধরণের মধ্যে এবং এর মধ্যে ভিন্নতা এখনও খুব একটা বোঝা যায়নি। আমরা যথাক্রমে মানব ভাস্টাস ল্যাটারালিস থেকে 1050 এবং 1038 টি পৃথক মায়োফাইব্রিলের উপর ট্রান্সক্রিপ্টমিক এবং প্রোটোমিক পদ্ধতি প্রয়োগ করেছি। প্রোটোমিক গবেষণায় পুরুষদের অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল এবং ট্রান্সক্রিপ্টমিক গবেষণায় 10 জন পুরুষ এবং 2 জন মহিলা অন্তর্ভুক্ত ছিল। মায়োসিন হেভি চেইন আইসোফর্ম ছাড়াও, আমরা বহুমাত্রিক ইন্টারমায়োফাইব্রিল পরিবর্তনশীলতার উৎস হিসাবে বিপাকীয় প্রোটিন, রাইবোসোমাল প্রোটিন এবং সেলুলার জংশনাল প্রোটিন সনাক্ত করেছি। তদুপরি, ধীর এবং দ্রুত তন্তুগুলির ক্লাস্টার সনাক্তকরণ সত্ত্বেও, আমাদের তথ্য থেকে জানা যায় যে টাইপ 2X তন্তুগুলি অন্যান্য দ্রুত-টুইচ তন্তু থেকে ফেনোটাইপিকভাবে আলাদা করা যায় না। তদুপরি, নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে মায়োফাইবার ফেনোটাইপ বর্ণনা করার জন্য মায়োসিন হেভি চেইন-ভিত্তিক শ্রেণীবিভাগ অপর্যাপ্ত। সামগ্রিকভাবে, আমাদের তথ্য বহুমাত্রিক মায়োফাইবার বৈচিত্র্যের ইঙ্গিত দেয়, যার বৈচিত্র্যের উৎস মায়োসিন হেভি চেইন আইসোফর্মের বাইরেও বিস্তৃত।
কোষীয় ভিন্নতা সকল জৈবিক ব্যবস্থার একটি অন্তর্নিহিত বৈশিষ্ট্য, যা কোষগুলিকে টিস্যু এবং কোষের বিভিন্ন চাহিদা পূরণের জন্য বিশেষজ্ঞ হতে দেয়। 1 কঙ্কালের পেশী ফাইবার ভিন্নতার ঐতিহ্যগত দৃষ্টিভঙ্গি হল যে মোটর নিউরনগুলি একটি মোটর ইউনিটের মধ্যে ফাইবারের ধরণ নির্ধারণ করে এবং ফাইবারের ধরণ (অর্থাৎ, মানুষের মধ্যে টাইপ 1, টাইপ 2A, এবং টাইপ 2X) মায়োসিন হেভি চেইন (MYH) আইসোফর্মের বৈশিষ্ট্য দ্বারা নির্ধারিত হয়। 2 এটি প্রাথমিকভাবে তাদের pH ATPase অস্থিরতার উপর ভিত্তি করে তৈরি করা হয়েছিল, 3,4 এবং পরে MYH এর তাদের আণবিক প্রকাশের উপর ভিত্তি করে। 5 যাইহোক, "মিশ্র" তন্তুগুলির সনাক্তকরণ এবং পরবর্তী গ্রহণযোগ্যতার সাথে যা বিভিন্ন অনুপাতে একাধিক MYH-কে সহ-প্রকাশ করে, কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলিকে ক্রমবর্ধমানভাবে স্বতন্ত্র ফাইবার প্রকারের পরিবর্তে একটি ধারাবাহিকতা হিসাবে দেখা হচ্ছে। 6 তা সত্ত্বেও, ক্ষেত্রটি এখনও মায়োফাইবার শ্রেণীবিভাগের জন্য প্রাথমিক শ্রেণীবিভাগকারী হিসাবে MYH-এর উপর ব্যাপকভাবে নির্ভর করে, একটি দৃষ্টিভঙ্গি সম্ভবত প্রাথমিক ইঁদুর গবেষণার সীমাবদ্ধতা এবং উল্লেখযোগ্য পক্ষপাত দ্বারা প্রভাবিত যার MYH প্রকাশ প্রোফাইল এবং ফাইবার ধরণের পরিসর মানুষের থেকে আলাদা। 2 পরিস্থিতি আরও জটিল এই কারণে যে বিভিন্ন মানুষের কঙ্কালের পেশী একটি বিভিন্ন ধরণের ফাইবার।৭ ভাস্টাস ল্যাটারালিস হল একটি মিশ্র পেশী যার একটি মধ্যবর্তী (এবং তাই প্রতিনিধিত্বকারী) MYH এক্সপ্রেশন প্রোফাইল রয়েছে।৭ অধিকন্তু, নমুনা গ্রহণের সহজতা এটিকে মানুষের মধ্যে সবচেয়ে বেশি অধ্যয়ন করা পেশী করে তোলে।
অতএব, শক্তিশালী "ওমিক্স" সরঞ্জাম ব্যবহার করে কঙ্কালের পেশী তন্তুর বৈচিত্র্যের নিরপেক্ষ তদন্ত অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ কিন্তু চ্যালেঞ্জিংও বটে, আংশিকভাবে কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলির বহু-নিউক্লিয়েটেড প্রকৃতির কারণে। যাইহোক, ট্রান্সক্রিপ্টমিক্স8,9 এবং প্রোটিওমিক্স10 প্রযুক্তি সাম্প্রতিক বছরগুলিতে বিভিন্ন প্রযুক্তিগত অগ্রগতির কারণে সংবেদনশীলতায় একটি বিপ্লবের মধ্য দিয়ে গেছে, যা একক-ফাইবার রেজোলিউশনে কঙ্কালের পেশী বিশ্লেষণের অনুমতি দেয়। ফলস্বরূপ, একক-ফাইবার বৈচিত্র্য এবং অ্যাট্রোফিক উদ্দীপনা এবং বার্ধক্যের প্রতি তাদের প্রতিক্রিয়া চিহ্নিত করার ক্ষেত্রে উল্লেখযোগ্য অগ্রগতি হয়েছে11,12,13,14,15,16,17,18। গুরুত্বপূর্ণভাবে, এই প্রযুক্তিগত অগ্রগতির ক্লিনিকাল প্রয়োগ রয়েছে, যা রোগ-সম্পর্কিত ডিসরেগুলেশনের আরও বিশদ এবং সুনির্দিষ্ট বৈশিষ্ট্য নির্ধারণের অনুমতি দেয়। উদাহরণস্বরূপ, নেমালাইন মায়োপ্যাথির প্যাথোফিজিওলজি, সবচেয়ে সাধারণ উত্তরাধিকারসূত্রে প্রাপ্ত পেশী রোগগুলির মধ্যে একটি (MIM 605355 এবং MIM 161800), জটিল এবং বিভ্রান্তিকর।19,20 অতএব, কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলির ডিসরেগুলেশনের আরও ভাল বৈশিষ্ট্য নির্ধারণ এই রোগ সম্পর্কে আমাদের বোঝার ক্ষেত্রে উল্লেখযোগ্য অগ্রগতির দিকে পরিচালিত করতে পারে।
আমরা মানব বায়োপসি নমুনা থেকে ম্যানুয়ালি বিচ্ছিন্ন একক কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলির ট্রান্সক্রিপ্টমিক এবং প্রোটিওমিক বিশ্লেষণের জন্য পদ্ধতি তৈরি করেছি এবং সেগুলিকে হাজার হাজার তন্তুতে প্রয়োগ করেছি, যার ফলে আমরা মানব কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলির কোষীয় বৈচিত্র্য তদন্ত করতে পেরেছি। এই কাজের সময়, আমরা পেশী তন্তুগুলির ট্রান্সক্রিপ্টমিক এবং প্রোটিওমিক ফেনোটাইপিংয়ের শক্তি প্রদর্শন করেছি এবং ইন্টারফাইবার পরিবর্তনশীলতার গুরুত্বপূর্ণ উৎস হিসাবে বিপাকীয়, রাইবোসোমাল এবং সেলুলার জংশনাল প্রোটিন চিহ্নিত করেছি। তদুপরি, এই প্রোটিওমিক কর্মপ্রবাহ ব্যবহার করে, আমরা একক কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলিতে নেমাটোড মায়োপ্যাথির ক্লিনিকাল প্রাসঙ্গিকতা চিহ্নিত করেছি, যা MYH-এর উপর ভিত্তি করে ফাইবারের ধরণের উপর নির্ভর করে অ-অক্সিডেটিভ তন্তুগুলির দিকে একটি সমন্বিত পরিবর্তন প্রকাশ করেছে।
মানুষের কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলির বৈচিত্র্য তদন্ত করার জন্য, আমরা একক কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলির ট্রান্সক্রিপ্টোম এবং প্রোটিওম বিশ্লেষণ সক্ষম করার জন্য দুটি কর্মপ্রবাহ তৈরি করেছি (চিত্র 1A এবং পরিপূরক চিত্র 1A)। আমরা নমুনা সংরক্ষণ এবং RNA এবং প্রোটিন অখণ্ডতা সংরক্ষণ থেকে শুরু করে প্রতিটি পদ্ধতির জন্য থ্রুপুট অপ্টিমাইজ করা পর্যন্ত বেশ কয়েকটি পদ্ধতিগত পদক্ষেপ তৈরি এবং অপ্টিমাইজ করেছি। ট্রান্সক্রিপ্টোম বিশ্লেষণের জন্য, বিপরীত ট্রান্সক্রিপশনের প্রাথমিক ধাপে নমুনা-নির্দিষ্ট আণবিক বারকোড সন্নিবেশ করে এটি অর্জন করা হয়েছিল, যার ফলে দক্ষ ডাউনস্ট্রিম প্রক্রিয়াকরণের জন্য 96টি ফাইবার একত্রিত করা সম্ভব হয়েছিল। ঐতিহ্যবাহী একক-কোষ পদ্ধতির তুলনায় গভীর সিকোয়েন্সিং (প্রতি ফাইবারে ±1 মিলিয়ন রিড) ট্রান্সক্রিপ্টোম ডেটাকে আরও সমৃদ্ধ করেছে। 21 প্রোটিওমিক্সের জন্য, আমরা উচ্চ থ্রুপুট বজায় রেখে প্রোটিওম গভীরতা অপ্টিমাইজ করার জন্য একটি timsTOF ভর স্পেকট্রোমিটারে DIA-PASEF ডেটা অধিগ্রহণের সাথে একটি সংক্ষিপ্ত ক্রোমাটোগ্রাফিক গ্রেডিয়েন্ট (21 মিনিট) ব্যবহার করেছি। 22,23 সুস্থ কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলির বৈচিত্র্য তদন্ত করার জন্য, আমরা 14 জন সুস্থ প্রাপ্তবয়স্ক দাতার 1,050টি পৃথক তন্তুর ট্রান্সক্রিপ্টোম এবং 5 জন সুস্থ প্রাপ্তবয়স্ক দাতার 1,038টি তন্তুর প্রোটিওম চিহ্নিত করেছি (পরিপূরক সারণী 1)। এই গবেষণাপত্রে, এই ডেটাসেটগুলিকে যথাক্রমে 1,000-ফাইবার ট্রান্সক্রিপ্টোম এবং প্রোটিওম হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে। আমাদের পদ্ধতি 1,000-ফাইবার ট্রান্সক্রিপ্টোমিক এবং প্রোটিওমিক বিশ্লেষণে মোট 27,237টি ট্রান্সক্রিপ্ট এবং 2,983টি প্রোটিন সনাক্ত করেছে (চিত্র 1A, পরিপূরক ডেটাসেট 1-2)। 1,000টি সনাক্ত করা জিন এবং প্রতি ফাইবারে 50% বৈধ মানের জন্য ট্রান্সক্রিপ্টোমিক এবং প্রোটিওমিক ডেটাসেট ফিল্টার করার পরে, ট্রান্সক্রিপ্টোম এবং প্রোটিওমে যথাক্রমে 925 এবং 974টি তন্তুর জন্য পরবর্তী বায়োইনফরমেটিক্স বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ফিল্টারিংয়ের পর, প্রতি ফাইবারে গড়ে ৪২৫৭ ± ১৫৫৭ জিন এবং ২০১৫ ± ২৩৪ প্রোটিন (গড় ± SD) সনাক্ত করা হয়েছিল, সীমিত আন্তঃব্যক্তিগত পরিবর্তনশীলতা সহ (পরিপূরক চিত্র ১বি-সি, পরিপূরক ডেটাসেট ৩-৪)। তবে, অংশগ্রহণকারীদের মধ্যে বিষয়ের মধ্যে পরিবর্তনশীলতা বেশি স্পষ্ট ছিল, সম্ভবত বিভিন্ন দৈর্ঘ্যের তন্তু এবং ক্রস-সেকশনাল এলাকার মধ্যে RNA/প্রোটিন ফলনের পার্থক্যের কারণে। বেশিরভাগ প্রোটিন (>২০০০) এর জন্য, পরিবর্তনের সহগ ২০% এর নিচে ছিল (পরিপূরক চিত্র ১ডি)। উভয় পদ্ধতিই পেশী সংকোচনের জন্য গুরুত্বপূর্ণ উচ্চ প্রকাশিত স্বাক্ষর সহ বিস্তৃত গতিশীল পরিসরের ট্রান্সক্রিপ্ট এবং প্রোটিন ক্যাপচার করার অনুমতি দেয় (যেমন, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (পরিপূরক চিত্র ১ই-এফ)। চিহ্নিত বৈশিষ্ট্যগুলির বেশিরভাগই ট্রান্সক্রিপ্টমিক এবং প্রোটমিক ডেটাসেটের মধ্যে সাধারণ ছিল (পরিপূরক চিত্র 1G), এবং এই বৈশিষ্ট্যগুলির গড় UMI/LFQ তীব্রতা যুক্তিসঙ্গতভাবে ভালভাবে সম্পর্কিত ছিল (r = 0.52) (পরিপূরক চিত্র 1H)।
ট্রান্সক্রিপ্টমিক্স এবং প্রোটিওমিক্স ওয়ার্কফ্লো (BioRender.com দিয়ে তৈরি)। MYH7, MYH2, এবং MYH1 এর জন্য BD ডায়নামিক রেঞ্জ কার্ভ এবং ফাইবার টাইপ অ্যাসাইনমেন্টের জন্য গণনা করা থ্রেশহোল্ড। E, F ট্রান্সক্রিপ্টমিক্স এবং প্রোটিওমিক্স ডেটাসেটে ফাইবার জুড়ে MYH এক্সপ্রেশনের বিতরণ। G, H ইউনিফর্ম ডাইভারসিটি অ্যাপ্রোক্সিমেশন এবং প্রজেকশন (UMAP) প্লটগুলি MYH-ভিত্তিক ফাইবার টাইপ দ্বারা রঙিন ট্রান্সক্রিপ্টমিক্স এবং প্রোটিওমিক্সের জন্য। I, J ট্রান্সক্রিপ্টমিক্স এবং প্রোটিওমিক্স ডেটাসেটে MYH7, MYH2, এবং MYH1 এক্সপ্রেশন দেখানো বৈশিষ্ট্য প্লট।
আমরা প্রাথমিকভাবে প্রতিটি ফাইবারের জন্য MYH-ভিত্তিক ফাইবার টাইপ নির্ধারণ করার সিদ্ধান্ত নিয়েছিলাম, যা Omics ডেটাসেটে MYH এক্সপ্রেশনের উচ্চ সংবেদনশীলতা এবং গতিশীল পরিসরের সুবিধা গ্রহণ করে। পূর্ববর্তী গবেষণায় ফাইবারগুলিকে বিশুদ্ধ টাইপ 1, টাইপ 2A, টাইপ 2X, অথবা বিভিন্ন MYHs11,14,24 এর নির্দিষ্ট শতাংশের প্রকাশের উপর ভিত্তি করে মিশ্র হিসাবে লেবেল করার জন্য নির্বিচারে থ্রেশহোল্ড ব্যবহার করা হয়েছে। আমরা একটি ভিন্ন পদ্ধতি ব্যবহার করেছি যেখানে প্রতিটি ফাইবারের এক্সপ্রেশনকে আমরা ফাইবার টাইপ করার জন্য যে MYHs ব্যবহার করেছি তার দ্বারা স্থান দেওয়া হয়েছিল: MYH7, MYH2, এবং MYH1, যথাক্রমে টাইপ 1, টাইপ 2A এবং টাইপ 2X ফাইবারের সাথে সম্পর্কিত। এরপর আমরা গাণিতিকভাবে প্রতিটি ফলের বক্ররেখার নিম্ন প্রতিবর্তন বিন্দু গণনা করেছি এবং প্রতিটি MYH এর জন্য ফাইবারগুলিকে ধনাত্মক (থ্রেশহোল্ডের উপরে) বা ঋণাত্মক (থ্রেশহোল্ডের নীচে) হিসাবে নির্ধারণ করার জন্য একটি থ্রেশহোল্ড হিসাবে ব্যবহার করেছি (চিত্র 1B-D)। এই তথ্যগুলি দেখায় যে প্রোটিন স্তরের তুলনায় RNA স্তরে MYH7 (চিত্র 1B) এবং MYH2 (চিত্র 1C) এর অন/অফ এক্সপ্রেশন প্রোফাইলগুলি আরও স্বতন্ত্র। প্রকৃতপক্ষে, প্রোটিন স্তরে, খুব কম ফাইবার MYH7 প্রকাশ করেনি, এবং কোনও ফাইবারের 100% MYH2 এক্সপ্রেশন ছিল না। আমরা পরবর্তীতে প্রতিটি ডেটাসেটের সমস্ত ফাইবারে MYH-ভিত্তিক ফাইবার প্রকার নির্ধারণের জন্য পূর্বনির্ধারিত এক্সপ্রেশন থ্রেশহোল্ড ব্যবহার করেছি। উদাহরণস্বরূপ, MYH7+/MYH2-/MYH1- ফাইবারগুলি টাইপ 1-এ বরাদ্দ করা হয়েছিল, যেখানে MYH7-/MYH2+/MYH1+ ফাইবারগুলি মিশ্র টাইপ 2A/2X-এ বরাদ্দ করা হয়েছিল (সম্পূর্ণ বিবরণের জন্য পরিপূরক সারণী 2 দেখুন)। সমস্ত ফাইবার একত্রিত করে, আমরা RNA (চিত্র 1E) এবং প্রোটিন (চিত্র 1F) উভয় স্তরে MYH-ভিত্তিক ফাইবার প্রকারের একটি উল্লেখযোগ্যভাবে একই রকম বন্টন লক্ষ্য করেছি, যেখানে MYH-ভিত্তিক ফাইবার প্রকারের আপেক্ষিক গঠন ব্যক্তিদের মধ্যে পরিবর্তিত হয়েছিল, যেমনটি প্রত্যাশা করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 2A)। বেশিরভাগ তন্তুকে বিশুদ্ধ টাইপ ১ (৩৪-৩৫%) অথবা টাইপ ২এ (৩৬-৩৮%) হিসেবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল, যদিও উল্লেখযোগ্য সংখ্যক মিশ্র টাইপ ২এ/২এক্স তন্তুও সনাক্ত করা হয়েছিল (১৬-১৯%)। একটি উল্লেখযোগ্য পার্থক্য হল বিশুদ্ধ টাইপ ২এক্স তন্তু শুধুমাত্র আরএনএ স্তরে সনাক্ত করা যেতে পারে, কিন্তু প্রোটিন স্তরে নয়, যা ইঙ্গিত দেয় যে দ্রুত MYH প্রকাশ অন্তত আংশিকভাবে ট্রান্সক্রিপশনের পরে নিয়ন্ত্রিত হয়।
আমরা অ্যান্টিবডি-ভিত্তিক ডট ব্লটিং ব্যবহার করে আমাদের প্রোটিওমিক্স-ভিত্তিক MYH ফাইবার টাইপিং পদ্ধতি যাচাই করেছি এবং উভয় পদ্ধতিই বিশুদ্ধ টাইপ 1 এবং টাইপ 2A ফাইবার সনাক্তকরণে 100% একমত হয়েছে (পরিপূরক চিত্র 2B দেখুন)। তবে, প্রোটিওমিক্স-ভিত্তিক পদ্ধতিটি আরও সংবেদনশীল, মিশ্র ফাইবার সনাক্তকরণে আরও দক্ষ এবং প্রতিটি ফাইবারে প্রতিটি MYH জিনের অনুপাত পরিমাপ করার ক্ষেত্রে আরও দক্ষ ছিল। এই তথ্যগুলি কঙ্কালের পেশী ফাইবারের ধরণগুলিকে চিহ্নিত করার জন্য একটি উদ্দেশ্যমূলক, অত্যন্ত সংবেদনশীল ওমিক্স-ভিত্তিক পদ্ধতি ব্যবহারের কার্যকারিতা প্রদর্শন করে।
এরপর আমরা ট্রান্সক্রিপ্টমিক্স এবং প্রোটিওমিক্স দ্বারা প্রদত্ত সম্মিলিত তথ্য ব্যবহার করে মায়োফাইবারগুলিকে তাদের সম্পূর্ণ ট্রান্সক্রিপ্টমিক্স বা প্রোটিওমের উপর ভিত্তি করে বস্তুনিষ্ঠভাবে শ্রেণীবদ্ধ করি। ইউনিফর্ম ম্যানিফোল্ড অ্যাক্রোমিক্সেশন এবং প্রক্ষেপণ (UMAP) পদ্ধতি ব্যবহার করে মাত্রিকতা ছয়টি প্রধান উপাদানে হ্রাস করতে সক্ষম হয়েছি (পরিপূরক চিত্র 3A–B), আমরা ট্রান্সক্রিপ্টমিক্স (চিত্র 1G) এবং প্রোটিওমে (চিত্র 1H) মায়োফাইবার পরিবর্তনশীলতা কল্পনা করতে সক্ষম হয়েছি। উল্লেখযোগ্যভাবে, মায়োফাইবারগুলিকে অংশগ্রহণকারীদের (পরিপূরক চিত্র 3C–D) বা পরীক্ষার দিনগুলি (পরিপূরক চিত্র 3E) দ্বারা ট্রান্সক্রিপ্টমিক্স বা প্রোটিওমিক্স ডেটাসেটে গোষ্ঠীভুক্ত করা হয়নি, যা পরামর্শ দেয় যে কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলিতে বিষয়ের মধ্যে পরিবর্তনশীলতা বিষয়ের মধ্যে পরিবর্তনশীলতার চেয়ে বেশি। UMAP প্লটে, "দ্রুত" এবং "ধীর" মায়োফাইবার প্রতিনিধিত্বকারী দুটি স্বতন্ত্র ক্লাস্টার আবির্ভূত হয়েছে (চিত্র 1G–H)। MYH7+ (ধীর) মায়োফাইবারগুলি UMAP1 এর ধনাত্মক মেরুতে ক্লাস্টার করা হয়েছিল, যেখানে MYH2+ এবং MYH1+ (দ্রুত) মায়োফাইবারগুলি UMAP1 এর ঋণাত্মক মেরুতে ক্লাস্টার করা হয়েছিল (চিত্র 1I–J)। তবে, MYH এক্সপ্রেশনের উপর ভিত্তি করে ফাস্ট-টুইচ ফাইবার ধরণের (অর্থাৎ, টাইপ 2A, টাইপ 2X, অথবা মিশ্র 2A/2X) মধ্যে কোনও পার্থক্য করা হয়নি, যা ইঙ্গিত করে যে MYH1 (চিত্র 1I–J) বা অন্যান্য ধ্রুপদী 2X মায়োফাইবার মার্কার যেমন ACTN3 বা MYLK2 (পরিপূরক চিত্র 4A–B) এক্সপ্রেশন সম্পূর্ণ ট্রান্সক্রিপ্টোম বা প্রোটিওম বিবেচনা করার সময় বিভিন্ন মায়োফাইবার ধরণের মধ্যে পার্থক্য করে না। অধিকন্তু, MYH2 এবং MYH7 এর সাথে তুলনা করলে, খুব কম ট্রান্সক্রিপ্ট বা প্রোটিন MYH1 এর সাথে ইতিবাচকভাবে সম্পর্কযুক্ত ছিল (পরিপূরক চিত্র 4C–H), যা পরামর্শ দেয় যে MYH1 প্রাচুর্য মায়োফাইবার ট্রান্সক্রিপ্টোম/প্রোটিওমকে সম্পূর্ণরূপে প্রতিফলিত করে না। UMAP স্তরে তিনটি MYH আইসোফর্মের মিশ্র অভিব্যক্তি মূল্যায়ন করার সময় একই রকম সিদ্ধান্তে পৌঁছানো হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 4I–J)। সুতরাং, শুধুমাত্র MYH পরিমাণ নির্ধারণের উপর ভিত্তি করে ট্রান্সক্রিপ্ট স্তরে 2X ফাইবার সনাক্ত করা গেলেও, সম্পূর্ণ ট্রান্সক্রিপ্টোম বা প্রোটিওম বিবেচনা করার সময় MYH1+ ফাইবারগুলি অন্যান্য দ্রুত ফাইবার থেকে আলাদা করা যায় না।
MYH-এর বাইরে ধীর ফাইবারের ভিন্নতার প্রাথমিক অনুসন্ধান হিসেবে, আমরা চারটি প্রতিষ্ঠিত ধীর ফাইবার টাইপ-নির্দিষ্ট প্রোটিন মূল্যায়ন করেছি: TPM3, TNNT1, MYL3, এবং ATP2A22। ট্রান্সক্রিপ্টমিক্স (পরিপূরক চিত্র 5A) এবং প্রোটিওমিক্স (পরিপূরক চিত্র 5B) উভয় ক্ষেত্রেই ধীর ফাইবার সাবটাইপগুলি MYH7-এর সাথে উচ্চ, যদিও নিখুঁত নয়, পিয়ারসনের পারস্পরিক সম্পর্ক দেখিয়েছে। ট্রান্সক্রিপ্টমিক্স (পরিপূরক চিত্র 5C) এবং প্রোটিওমিক্স (পরিপূরক চিত্র 5D) -এ যথাক্রমে সমস্ত জিন/প্রোটিন সাবটাইপ দ্বারা প্রায় 25% এবং 33% ধীর ফাইবারকে বিশুদ্ধ ধীর ফাইবার হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়নি। অতএব, একাধিক জিন/প্রোটিন সাবটাইপের উপর ভিত্তি করে ধীর ফাইবার শ্রেণীবিন্যাস অতিরিক্ত জটিলতার পরিচয় দেয়, এমনকি ফাইবার টাইপ-নির্দিষ্ট হিসাবে পরিচিত প্রোটিনগুলির জন্যও। এটি পরামর্শ দেয় যে একটি একক জিন/প্রোটিন পরিবারের আইসোফর্মের উপর ভিত্তি করে ফাইবার শ্রেণীবিন্যাস কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলির প্রকৃত ভিন্নতা পর্যাপ্তভাবে প্রতিফলিত নাও হতে পারে।
সমগ্র ওমিক্স মডেলের স্কেলে মানুষের কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলির ফেনোটাইপিক পরিবর্তনশীলতা আরও অন্বেষণ করার জন্য, আমরা প্রধান উপাদান বিশ্লেষণ (PCA) (চিত্র 2A) ব্যবহার করে ডেটার নিরপেক্ষ মাত্রিকতা হ্রাস সম্পাদন করেছি। UMAP প্লটের মতো, অংশগ্রহণকারী বা পরীক্ষার দিন কেউই PCA স্তরে ফাইবার ক্লাস্টারিংকে প্রভাবিত করেনি (পরিপূরক চিত্র 6A–C)। উভয় ডেটাসেটে, MYH-ভিত্তিক ফাইবার প্রকারটি PC2 দ্বারা ব্যাখ্যা করা হয়েছিল, যা ধীর-টুইচ টাইপ 1 ফাইবারের একটি ক্লাস্টার এবং দ্রুত-টুইচ টাইপ 2A, টাইপ 2X এবং মিশ্র 2A/2X ফাইবার ধারণকারী একটি দ্বিতীয় ক্লাস্টার দেখিয়েছিল (চিত্র 2A)। উভয় ডেটাসেটে, এই দুটি ক্লাস্টার অল্প সংখ্যক মিশ্র টাইপ 1/2A ফাইবার দ্বারা সংযুক্ত ছিল। যেমনটি প্রত্যাশা করা হয়েছিল, প্রধান পিসি ড্রাইভারগুলির অতিরিক্ত প্রতিনিধিত্ব বিশ্লেষণ নিশ্চিত করেছে যে PC2 সংকোচনশীল এবং বিপাকীয় স্বাক্ষর দ্বারা চালিত হয়েছিল (চিত্র 2B এবং পরিপূরক চিত্র 6D–E, পরিপূরক ডেটাসেট 5–6)। সামগ্রিকভাবে, MYH-ভিত্তিক ফাইবার টাইপটি PC2 বরাবর ক্রমাগত পরিবর্তন ব্যাখ্যা করার জন্য যথেষ্ট বলে প্রমাণিত হয়েছে, তথাকথিত 2X ফাইবারগুলি বাদে যা দ্রুত ক্লাস্টারের মধ্যে ট্রান্সক্রিপ্টোম জুড়ে বিতরণ করা হয়েছিল।
A. MYH এর উপর ভিত্তি করে ফাইবারের ধরণ অনুসারে ট্রান্সক্রিপ্টোম এবং প্রোটিওম ডেটাসেটের প্রধান উপাদান বিশ্লেষণ (PCA) প্লটগুলি রঙ করা হয়েছে। B. PC2 এবং PC1-এ ট্রান্সক্রিপ্ট এবং প্রোটিন ড্রাইভারগুলির সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ। ক্লাস্টারপ্রোফাইলার প্যাকেজ এবং বেঞ্জামিনী-হচবার্গের সমন্বয়কৃত p-মান ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। C, D. প্রোটিওমে ট্রান্সক্রিপ্টোম এবং কস্টামের GO পদগুলিতে আন্তঃকোষীয় আনুগত্য জিন অনটোলজি (GO) পদ অনুসারে রঙ করা হয়েছে। তীরগুলি ট্রান্সক্রিপ্ট এবং প্রোটিন ড্রাইভার এবং তাদের দিকনির্দেশনা উপস্থাপন করে। E, F. ইউনিফর্ম ম্যানিফোল্ড আনুমানিকতা এবং প্রক্ষেপণ (UMAP) ধীর/দ্রুত ফাইবার প্রকারের থেকে স্বাধীনভাবে এক্সপ্রেশন গ্রেডিয়েন্টগুলি দেখানো ক্লিনিক্যালি প্রাসঙ্গিক বৈশিষ্ট্যগুলির প্লটগুলিকে বৈশিষ্ট্যযুক্ত করে। G, H. ট্রান্সক্রিপ্টোম এবং প্রোটিওমে PC2 এবং PC1 ড্রাইভারের মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ক।
অপ্রত্যাশিতভাবে, MYH-ভিত্তিক মায়োফাইবার টাইপ পরিবর্তনশীলতার দ্বিতীয় সর্বোচ্চ মাত্রা (PC2) ব্যাখ্যা করেছে, যা পরামর্শ দেয় যে MYH-ভিত্তিক মায়োফাইবার টাইপ (PC1) এর সাথে সম্পর্কিত নয় এমন অন্যান্য জৈবিক কারণগুলি কঙ্কালের পেশী ফাইবারের বৈচিত্র্য নিয়ন্ত্রণে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। PC1-এর শীর্ষ চালকদের অতিরিক্ত উপস্থাপনা বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে PC1-এর পরিবর্তনশীলতা মূলত ট্রান্সক্রিপ্টোমে কোষ-কোষ আনুগত্য এবং রাইবোসোম সামগ্রী এবং প্রোটিওমে কস্টামের এবং রাইবোসোমাল প্রোটিন দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল (চিত্র 2B এবং পরিপূরক চিত্র 6D-E, পরিপূরক ডেটা সেট 7)। কঙ্কালের পেশীতে, কস্টামেরগুলি Z-ডিস্ককে সারকোলেমার সাথে সংযুক্ত করে এবং বল সংক্রমণ এবং সংকেতের সাথে জড়িত। 25 কোষ-কোষ আনুগত্য (ট্রান্সক্রিপ্টোম, চিত্র 2C) এবং কস্টামের (প্রোটিওম, চিত্র 2D) বৈশিষ্ট্যগুলি ব্যবহার করে টীকাযুক্ত PCA প্লটগুলি PC1-এ একটি শক্তিশালী বাম স্থানান্তর প্রকাশ করেছে, যা নির্দেশ করে যে এই বৈশিষ্ট্যগুলি নির্দিষ্ট ফাইবারগুলিতে সমৃদ্ধ।
UMAP স্তরে মায়োফাইবার ক্লাস্টারিংয়ের আরও বিশদ পরীক্ষায় দেখা গেছে যে বেশিরভাগ বৈশিষ্ট্যই মায়োফাইবার সাবক্লাস্টার-নির্দিষ্টের পরিবর্তে মায়োফাইবার টাইপ-স্বাধীন MYH-ভিত্তিক এক্সপ্রেশন গ্রেডিয়েন্ট প্রদর্শন করেছে। এই ধারাবাহিকতা রোগগত অবস্থার সাথে সম্পর্কিত বেশ কয়েকটি জিনের জন্য পরিলক্ষিত হয়েছে (চিত্র 2E), যেমন CHCHD10 (নিউরোমাসকুলার রোগ), SLIT3 (পেশী অ্যাট্রোফি), CTDNEP1 (পেশী রোগ)। এই ধারাবাহিকতা প্রোটিওম জুড়েও পরিলক্ষিত হয়েছে, যার মধ্যে স্নায়বিক ব্যাধি (UGDH), ইনসুলিন সিগন্যালিং (PHIP), এবং ট্রান্সক্রিপশন (HIST1H2AB) (চিত্র 2F) এর সাথে সম্পর্কিত প্রোটিন অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। সম্মিলিতভাবে, এই তথ্যগুলি বিভিন্ন মায়োফাইবার জুড়ে ফাইবার টাইপ-স্বাধীন ধীর/দ্রুত টুইচ ভিন্নতার ধারাবাহিকতা নির্দেশ করে।
মজার বিষয় হল, PC2-তে ড্রাইভার জিনগুলি ভাল ট্রান্সক্রিপ্টোম-প্রোটিওম পারস্পরিক সম্পর্ক দেখিয়েছে (r = 0.663) (চিত্র 2G), যা ইঙ্গিত করে যে ধীর এবং দ্রুত-টুইচ ফাইবারের ধরণগুলি, এবং বিশেষ করে কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলির সংকোচনশীল এবং বিপাকীয় বৈশিষ্ট্যগুলি, ট্রান্সক্রিপশনালভাবে নিয়ন্ত্রিত। যাইহোক, PC1-তে ড্রাইভার জিনগুলি কোনও ট্রান্সক্রিপ্টোম-প্রোটিওম পারস্পরিক সম্পর্ক দেখায়নি (r = -0.027) (চিত্র 2H), যা পরামর্শ দেয় যে ধীর/দ্রুত-টুইচ ফাইবারের ধরণের সাথে সম্পর্কিত নয় এমন বৈচিত্রগুলি মূলত পোস্ট-ট্রান্সক্রিপশনালভাবে নিয়ন্ত্রিত হয়। যেহেতু PC1-এর বৈচিত্রগুলি প্রাথমিকভাবে রাইবোসোমাল জিন অনটোলজি পদ দ্বারা ব্যাখ্যা করা হয়েছিল, এবং যেহেতু রাইবোসোমগুলি প্রোটিন অনুবাদে সক্রিয়ভাবে অংশগ্রহণ এবং প্রভাবিত করে কোষে একটি গুরুত্বপূর্ণ এবং বিশেষ ভূমিকা পালন করে, 31 আমরা পরবর্তীতে এই অপ্রত্যাশিত রাইবোসোমাল বৈচিত্র্য তদন্ত করার জন্য বেরিয়ে পড়েছিলাম।
আমরা প্রথমে GOCC শব্দ "সাইটোপ্লাজমিক রাইবোসোম" (চিত্র 3A) তে প্রোটিনের আপেক্ষিক প্রাচুর্য অনুসারে প্রোটিওমিক্সের প্রধান উপাদান বিশ্লেষণ প্লটটি রঙ করেছি। যদিও এই শব্দটি PC1 এর ইতিবাচক দিকে সমৃদ্ধ, যার ফলে একটি ছোট গ্রেডিয়েন্ট তৈরি হয়, রাইবোসোমাল প্রোটিনগুলি PC1 এর উভয় দিকেই বিভাজন চালায় (চিত্র 3A)। PC1 এর নেতিবাচক দিকে সমৃদ্ধ রাইবোসোমাল প্রোটিনগুলির মধ্যে RPL18, RPS18 এবং RPS13 (চিত্র 3B) অন্তর্ভুক্ত ছিল, যেখানে RPL31, RPL35 এবং RPL38 (চিত্র 3C) PC1 এর ইতিবাচক দিকের প্রধান চালিকাশক্তি ছিল। মজার বিষয় হল, RPL38 এবং RPS13 অন্যান্য টিস্যুর তুলনায় কঙ্কালের পেশীতে অত্যন্ত প্রকাশিত হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 7A)। PC1-এর এই স্বতন্ত্র রাইবোসোমাল স্বাক্ষরগুলি ট্রান্সক্রিপ্টোমে (পরিপূরক চিত্র 7B) পরিলক্ষিত হয়নি, যা ট্রান্সক্রিপশন-পরবর্তী নিয়ন্ত্রণ নির্দেশ করে।
A. প্রোটিওম জুড়ে সাইটোপ্লাজমিক রাইবোসোমাল জিন অন্টোলজি (GO) পদ অনুসারে প্রধান উপাদান বিশ্লেষণ (PCA) প্লট রঙ করা হয়েছে। তীরগুলি PCA প্লটে প্রোটিন-মধ্যস্থতাকারী পরিবর্তনের দিক নির্দেশ করে। রেখার দৈর্ঘ্য একটি নির্দিষ্ট প্রোটিনের জন্য প্রধান উপাদান স্কোরের সাথে মিলে যায়। B, C. RPS13 এবং RPL38 এর জন্য PCA বৈশিষ্ট্য প্লট। D. সাইটোপ্লাজমিক রাইবোসোমাল প্রোটিনের অতত্ত্বাবধানে শ্রেণিবদ্ধ ক্লাস্টারিং বিশ্লেষণ। E. 80S রাইবোসোমের কাঠামোগত মডেল (PDB: 4V6X) যা কঙ্কালের পেশী তন্তুতে বিভিন্ন প্রাচুর্য সহ রাইবোসোমাল প্রোটিনগুলিকে হাইলাইট করে। F. mRNA এক্সিট চ্যানেলের কাছে স্থানীয়করণ করা বিভিন্ন স্টোইচিওমেট্রি সহ রাইবোসোমাল প্রোটিন।
রাইবোসোমাল ভিন্নতা এবং বিশেষীকরণের ধারণাগুলি পূর্বে প্রস্তাব করা হয়েছে, যেখানে স্বতন্ত্র রাইবোসোম উপ-জনসংখ্যার উপস্থিতি (রাইবোসোমাল ভিন্নতা) বিভিন্ন টিস্যুতে প্রোটিন অনুবাদকে সরাসরি প্রভাবিত করতে পারে32 এবং কোষে33 নির্দিষ্ট mRNA ট্রান্সক্রিপ্ট পুল34 (রাইবোসোম বিশেষীকরণ) এর নির্বাচনী অনুবাদের মাধ্যমে। কঙ্কালের পেশী তন্তুতে সহ-প্রকাশিত রাইবোসোমাল প্রোটিনের উপ-জনসংখ্যা সনাক্ত করার জন্য, আমরা প্রোটিওমে রাইবোসোমাল প্রোটিনের একটি তত্ত্বাবধানহীন শ্রেণিবদ্ধ ক্লাস্টারিং বিশ্লেষণ করেছি (চিত্র 3D, পরিপূরক ডেটা সেট 8)। যেমনটি প্রত্যাশা করা হয়েছিল, MYH এর উপর ভিত্তি করে রাইবোসোমাল প্রোটিনগুলি ফাইবারের ধরণ অনুসারে ক্লাস্টার করেনি। যাইহোক, আমরা রাইবোসোমাল প্রোটিনের তিনটি স্বতন্ত্র ক্লাস্টার সনাক্ত করেছি; প্রথম ক্লাস্টার (রাইবোসোমাল_ক্লাস্টার_1) RPL38 এর সাথে সহ-নিয়ন্ত্রিত এবং তাই একটি ইতিবাচক PC1 প্রোফাইল সহ ফাইবারগুলিতে অভিব্যক্তি বৃদ্ধি পেয়েছে। দ্বিতীয় ক্লাস্টার (রাইবোসোমাল_ক্লাস্টার_2) RPS13 এর সাথে সহ-নিয়ন্ত্রিত এবং একটি নেতিবাচক PC1 প্রোফাইল সহ ফাইবারগুলিতে উন্নত। তৃতীয় ক্লাস্টার (ribosomal_cluster_3) কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলিতে সমন্বিত ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন দেখায় না এবং এটিকে "মূল" কঙ্কালের পেশী রাইবোসোমাল প্রোটিন হিসাবে বিবেচনা করা যেতে পারে। 1 এবং 2 উভয় রাইবোসোমাল ক্লাস্টারেই রাইবোসোমাল প্রোটিন রয়েছে যা পূর্বে বিকল্প অনুবাদ নিয়ন্ত্রণ করতে দেখা গেছে (যেমন, RPL10A, RPL38, RPS19, এবং RPS25) এবং কার্যকরীভাবে বিকাশকে প্রভাবিত করে (যেমন, RPL10A, RPL38)।34,35,36,37,38 PCA ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, তন্তুগুলিতে এই রাইবোসোমাল প্রোটিনগুলির পর্যবেক্ষণ করা ভিন্নধর্মী উপস্থাপনাও ধারাবাহিকতা দেখিয়েছে (পরিপূরক চিত্র 7C)।
রাইবোসোমের মধ্যে ভিন্নধর্মী রাইবোসোমাল প্রোটিনের অবস্থান কল্পনা করার জন্য, আমরা মানব 80S রাইবোসোমের একটি কাঠামোগত মডেল ব্যবহার করেছি (প্রোটিন ডেটা ব্যাংক: 4V6X) (চিত্র 3E)। বিভিন্ন রাইবোসোমাল ক্লাস্টারের রাইবোসোমাল প্রোটিনগুলিকে বিচ্ছিন্ন করার পরে, তাদের অবস্থানগুলি ঘনিষ্ঠভাবে সারিবদ্ধ ছিল না, যা ইঙ্গিত দেয় যে আমাদের পদ্ধতি রাইবোসোমের নির্দিষ্ট অঞ্চল/ভগ্নাংশের জন্য সমৃদ্ধি প্রদান করতে ব্যর্থ হয়েছে। তবে মজার বিষয় হল, ক্লাস্টার 2-এ বৃহৎ সাবইউনিট প্রোটিনের অনুপাত ক্লাস্টার 1 এবং 3 (পরিপূরক চিত্র 7D) এর তুলনায় কম ছিল। আমরা লক্ষ্য করেছি যে কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলিতে পরিবর্তিত স্টোইচিওমেট্রি সহ প্রোটিনগুলি মূলত রাইবোসোম পৃষ্ঠে স্থানীয়করণ করা হয়েছিল (চিত্র 3E), বিভিন্ন mRNA জনসংখ্যার অভ্যন্তরীণ রাইবোসোম এন্ট্রি সাইট (IRES) উপাদানগুলির সাথে মিথস্ক্রিয়া করার ক্ষমতার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যার ফলে নির্বাচনী অনুবাদ সমন্বয় করা হয়। 40, 41 তদুপরি, কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলিতে পরিবর্তিত স্টোইচিওমেট্রি সহ অনেক প্রোটিন কার্যকরী অঞ্চলের কাছাকাছি অবস্থিত ছিল যেমন mRNA প্রস্থান টানেল (চিত্র 3F), যা নির্বাচনীভাবে অনুবাদমূলক প্রসারণ এবং নির্দিষ্ট পেপটাইডের আটক নিয়ন্ত্রণ করে। ৪২ সংক্ষেপে, আমাদের তথ্য থেকে জানা যায় যে কঙ্কালের পেশী রাইবোসোমাল প্রোটিনের স্টোইকিওমেট্রি ভিন্নতা প্রদর্শন করে, যার ফলে কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলির মধ্যে পার্থক্য দেখা দেয়।
এরপর আমরা দ্রুত এবং ধীর-টুইচ ফাইবার স্বাক্ষর সনাক্তকরণ এবং তাদের ট্রান্সক্রিপশনাল নিয়ন্ত্রণের প্রক্রিয়াগুলি অন্বেষণ করার জন্য বেরিয়ে পড়লাম। দুটি ডেটাসেটে (চিত্র 1G-H এবং 4A-B) UMAP দ্বারা সংজ্ঞায়িত দ্রুত এবং ধীর-টুইচ ফাইবার ক্লাস্টারগুলির তুলনা করে, ট্রান্সক্রিপ্টমিক এবং প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ যথাক্রমে 1366 এবং 804 টি পৃথকভাবে প্রচুর বৈশিষ্ট্য চিহ্নিত করেছে (চিত্র 4A-B, পরিপূরক ডেটাসেট 9-12)। আমরা সারকোমেরেস (যেমন, ট্রোপোমায়োসিন এবং ট্রোপোনিন), উত্তেজনা-সংকোচন সংযোগ (SERCA আইসোফর্ম), এবং শক্তি বিপাক (যেমন, ALDOA এবং CKB) সম্পর্কিত স্বাক্ষরের প্রত্যাশিত পার্থক্য লক্ষ্য করেছি। অধিকন্তু, প্রোটিন সর্বব্যাপীকরণ নিয়ন্ত্রণকারী ট্রান্সক্রিপ্ট এবং প্রোটিনগুলি দ্রুত এবং ধীর-টুইচ ফাইবারগুলিতে (যেমন, USP54, SH3RF2, USP28, এবং USP48) পৃথকভাবে প্রকাশ করা হয়েছিল (চিত্র 4A-B)। অধিকন্তু, মাইক্রোবিয়াল প্রোটিন জিন RP11-451G4.2 (DWORF), যা পূর্বে ল্যাম্ব পেশী ফাইবারের ধরণগুলিতে পৃথকভাবে প্রকাশিত হয়েছে এবং কার্ডিয়াক পেশীতে SERCA কার্যকলাপ বৃদ্ধি করে, ধীর কঙ্কালের পেশী ফাইবারগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে আপরেগুলেটেড ছিল (চিত্র 4A)। একইভাবে, পৃথক ফাইবার স্তরে, বিপাক-সম্পর্কিত ল্যাকটেট ডিহাইড্রোজেনেস আইসোফর্ম (LDHA এবং LDHB, চিত্র 4C এবং পরিপূরক চিত্র 8A) 45,46 এর মতো পরিচিত স্বাক্ষরগুলিতে এবং পূর্বে অজানা ফাইবার-টাইপ-নির্দিষ্ট স্বাক্ষরগুলিতে (যেমন IRX3, USP54, USP28, এবং DPYSL3) (চিত্র 4C) উল্লেখযোগ্য পার্থক্য লক্ষ্য করা গেছে। ট্রান্সক্রিপ্টমিক এবং প্রোটিওমিক ডেটাসেটগুলির মধ্যে পৃথকভাবে প্রকাশিত বৈশিষ্ট্যগুলির একটি উল্লেখযোগ্য ওভারল্যাপ ছিল (পরিপূরক চিত্র 8B), পাশাপাশি একটি ভাঁজ পরিবর্তন সম্পর্ক ছিল যা মূলত সারকোমের বৈশিষ্ট্যগুলির আরও স্পষ্ট ডিফারেনশিয়াল প্রকাশ দ্বারা চালিত হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 8C)। উল্লেখযোগ্যভাবে, কিছু স্বাক্ষর (যেমন USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) শুধুমাত্র প্রোটিওমিক স্তরে শক্তিশালী পোস্ট-ট্রান্সক্রিপশনাল নিয়ন্ত্রণ দেখিয়েছিল এবং ধীর/দ্রুত টুইচ ফাইবার টাইপ-নির্দিষ্ট এক্সপ্রেশন প্রোফাইল ছিল (পরিপূরক চিত্র 8C)।
চিত্র 1G–H-এ ইউনিফর্ম ম্যানিফোল্ড অ্যাক্সিমেশন এবং প্রজেকশন (UMAP) প্লট দ্বারা চিহ্নিত ধীর এবং দ্রুত ক্লাস্টারের তুলনা করে A এবং B আগ্নেয়গিরির প্লট। রঙিন বিন্দুগুলি FDR < 0.05 এ উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন ট্রান্সক্রিপ্ট বা প্রোটিনকে প্রতিনিধিত্ব করে এবং গাঢ় বিন্দুগুলি লগ পরিবর্তন > 1 এ উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন ট্রান্সক্রিপ্ট বা প্রোটিনকে প্রতিনিধিত্ব করে। দ্বি-মুখী পরিসংখ্যান বিশ্লেষণ DESeq2 ওয়াল্ড পরীক্ষা ব্যবহার করে বেঞ্জামিনী-হচবার্গ অ্যাডজাস্টেড p মান (ট্রান্সক্রিপ্টমিক্স) বা লিমা লিনিয়ার মডেল পদ্ধতি ব্যবহার করে অভিজ্ঞতামূলক বেয়েসিয়ান বিশ্লেষণের মাধ্যমে করা হয়েছিল এবং তারপরে একাধিক তুলনার জন্য বেঞ্জামিনী-হচবার্গ অ্যাডজাস্টমেন্ট (প্রোটিওমিক্স) করা হয়েছিল। C ধীর এবং দ্রুত তন্তুগুলির মধ্যে নির্বাচিত ডিফারেন্সিয়ালভাবে প্রকাশিত জিন বা প্রোটিনের স্বাক্ষর প্লট। D উল্লেখযোগ্যভাবে ডিফারেন্সিয়ালভাবে প্রকাশিত ট্রান্সক্রিপ্ট এবং প্রোটিনের সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ। ওভারল্যাপিং মান উভয় ডেটাসেটে সমৃদ্ধ করা হয়, ট্রান্সক্রিপ্টোম মানগুলি কেবল ট্রান্সক্রিপ্টোমে সমৃদ্ধ করা হয় এবং প্রোটিওম মানগুলি কেবল প্রোটিওমে সমৃদ্ধ করা হয়। বেঞ্জামিনী-হচবার্গ অ্যাডজাস্টেড p-মানগুলির সাথে ক্লাস্টার প্রোফাইলার প্যাকেজ ব্যবহার করে পরিসংখ্যান বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। E. SCENIC-প্রাপ্ত নিয়ন্ত্রক নির্দিষ্টতা স্কোর এবং ফাইবার প্রকারের মধ্যে ডিফারেনশিয়াল mRNA এক্সপ্রেশনের উপর ভিত্তি করে SCENIC দ্বারা চিহ্নিত ফাইবার প্রকার-নির্দিষ্ট ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর। F. ধীর এবং দ্রুত ফাইবারের মধ্যে ডিফারেনশিয়ালভাবে প্রকাশিত নির্বাচিত ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরগুলির প্রোফাইলিং।
এরপর আমরা পৃথকভাবে প্রতিনিধিত্ব করা জিন এবং প্রোটিনের একটি অতিরিক্ত প্রতিনিধিত্ব বিশ্লেষণ করলাম (চিত্র 4D, পরিপূরক ডেটা সেট 13)। দুটি ডেটাসেটের মধ্যে পার্থক্যকারী বৈশিষ্ট্যগুলির জন্য পথ সমৃদ্ধকরণ প্রত্যাশিত পার্থক্য প্রকাশ করেছে, যেমন ফ্যাটি অ্যাসিড β-জারণ এবং কেটোন বিপাক প্রক্রিয়া (ধীর তন্তু), মায়োফিলামেন্ট/পেশী সংকোচন (যথাক্রমে দ্রুত এবং ধীর তন্তু), এবং কার্বোহাইড্রেট ক্যাটাবলিক প্রক্রিয়া (দ্রুত তন্তু)। দ্রুত তন্তুগুলিতে সেরিন/থ্রিওনাইন প্রোটিন ফসফেটেজ কার্যকলাপও বৃদ্ধি পেয়েছিল, যা নিয়ন্ত্রক এবং অনুঘটক ফসফেটেজ সাবইউনিট (PPP3CB, PPP1R3D, এবং PPP1R3A) এর মতো বৈশিষ্ট্য দ্বারা চালিত হয়েছিল, যা গ্লাইকোজেন বিপাক নিয়ন্ত্রণ করতে পরিচিত (47) (পরিপূরক চিত্র 8D–E)। দ্রুত তন্তু সমৃদ্ধ অন্যান্য পথের মধ্যে রয়েছে প্রোটিওমে (পরিপূরক চিত্র 8F) প্রক্রিয়াকরণ (P-) বডি (YTHDF3, TRIM21, LSM2), সম্ভাব্যভাবে ট্রান্সক্রিপশন পরবর্তী নিয়ন্ত্রণে জড়িত (48), এবং ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর কার্যকলাপ (SREBF1, RXRG, RORA) ট্রান্সক্রিপ্টোমে (পরিপূরক চিত্র 8G)। ধীর তন্তুগুলি অক্সিডোরেডাক্টেস কার্যকলাপ (BDH1, DCXR, TXN2) (পরিপূরক চিত্র 8H), অ্যামাইড বাইন্ডিং (CPTP, PFDN2, CRYAB) (পরিপূরক চিত্র 8I), বহির্কোষীয় ম্যাট্রিক্স (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (পরিপূরক চিত্র 8J), এবং রিসেপ্টর-লিগ্যান্ড কার্যকলাপ (FNDC5, SPX, NENF) (পরিপূরক চিত্র 8K) সমৃদ্ধ।
ধীর/দ্রুত পেশী ফাইবার ধরণের বৈশিষ্ট্যের অন্তর্নিহিত ট্রান্সক্রিপশনাল নিয়ন্ত্রণ সম্পর্কে আরও অন্তর্দৃষ্টি অর্জনের জন্য, আমরা SCENIC49 (পরিপূরক ডেটা সেট 14) ব্যবহার করে ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ করেছি। দ্রুত এবং ধীর পেশী ফাইবারের মধ্যে অনেক ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ করা হয়েছিল (চিত্র 4E)। এর মধ্যে MAFA এর মতো ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর অন্তর্ভুক্ত ছিল, যা পূর্বে দ্রুত পেশী ফাইবার বিকাশের সাথে যুক্ত ছিল, 50 পাশাপাশি বেশ কয়েকটি ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর যা পূর্বে পেশী ফাইবার টাইপ-নির্দিষ্ট জিন প্রোগ্রামের সাথে সম্পর্কিত ছিল না। এর মধ্যে, PITX1, EGR1, এবং MYF6 দ্রুত পেশী ফাইবারগুলিতে সবচেয়ে সমৃদ্ধ ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর ছিল (চিত্র 4E)। বিপরীতে, ZSCAN30 এবং EPAS1 (HIF2A নামেও পরিচিত) ধীর পেশী ফাইবারগুলিতে সবচেয়ে সমৃদ্ধ ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর ছিল (চিত্র 4E)। এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, দ্রুত পেশী ফাইবারগুলির সাথে সম্পর্কিত UMAP অঞ্চলে MAFA উচ্চ স্তরে প্রকাশ করা হয়েছিল, যেখানে EPAS1 এর বিপরীত প্রকাশ প্যাটার্ন ছিল (চিত্র 4F)।
পরিচিত প্রোটিন-কোডিং জিন ছাড়াও, অসংখ্য নন-কোডিং RNA বায়োটাইপ রয়েছে যা মানব বিকাশ এবং রোগ নিয়ন্ত্রণে জড়িত থাকতে পারে। 51, 52 ট্রান্সক্রিপ্টোম ডেটাসেটে, বেশ কয়েকটি নন-কোডিং RNA ফাইবার ধরণের নির্দিষ্টতা প্রদর্শন করে (চিত্র 5A এবং পরিপূরক ডেটাসেট 15), যার মধ্যে LINC01405 অন্তর্ভুক্ত, যা ধীর তন্তুগুলির জন্য অত্যন্ত নির্দিষ্ট এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল মায়োপ্যাথি রোগীদের পেশীতে হ্রাস পেয়েছে বলে জানা গেছে। 53 বিপরীতে, lnc-ERCC5-5 জিন (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54 এর সাথে সম্পর্কিত RP11-255P5.3 দ্রুত ফাইবার ধরণের নির্দিষ্টতা প্রদর্শন করে। LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) এবং RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) উভয়ই কঙ্কালের পেশীর নির্দিষ্টতা প্রদর্শন করে (পরিপূরক চিত্র 9A–B) এবং তাদের 1 Mb জিনোমিক আশেপাশে কোনও পরিচিত সংকোচনশীল জিন নেই, যা ইঙ্গিত দেয় যে তারা প্রতিবেশী সংকোচনশীল জিন নিয়ন্ত্রণের পরিবর্তে ফাইবারের ধরণ নিয়ন্ত্রণে একটি বিশেষ ভূমিকা পালন করে। যথাক্রমে LINC01405 এবং RP11-255P5.3 এর ধীর/দ্রুত ফাইবারের ধরণ-নির্দিষ্ট এক্সপ্রেশন প্রোফাইলগুলি RNAscope (চিত্র 5B–C) ব্যবহার করে নিশ্চিত করা হয়েছে।
A. নন-কোডিং RNA ট্রান্সক্রিপ্টগুলি ধীর এবং দ্রুত-টুইচ পেশী তন্তুগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে নিয়ন্ত্রিত হয়। B. প্রতিনিধিত্বমূলক RNAscope চিত্রগুলি যথাক্রমে LINC01405 এবং RP11-255P5.3 এর ধীর এবং দ্রুত-টুইচ ফাইবার ধরণের নির্দিষ্টতা দেখায়। স্কেল বার = 50 μm। C. RNAscope দ্বারা নির্ধারিত মায়োফাইবার টাইপ-নির্দিষ্ট নন-কোডিং RNA এক্সপ্রেশনের পরিমাণ নির্ধারণ (n = 3টি স্বাধীন ব্যক্তি থেকে বায়োপসি, প্রতিটি ব্যক্তির মধ্যে দ্রুত এবং ধীর পেশী তন্তুগুলির তুলনা করে)। পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ একটি দ্বি-লেজযুক্ত ছাত্রের টি-টেস্ট ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল। বক্স প্লটগুলি মধ্যমা এবং প্রথম এবং তৃতীয় কোয়ার্টাইল দেখায়, যেখানে হুইস্কারগুলি সর্বনিম্ন এবং সর্বাধিক মান নির্দেশ করে। D. ডি নভো মাইক্রোবিয়াল প্রোটিন সনাক্তকরণ কর্মপ্রবাহ (BioRender.com দিয়ে তৈরি)। E. মাইক্রোবায়াল প্রোটিন LINC01405_ORF408:17441:17358 বিশেষভাবে ধীর কঙ্কালের পেশী তন্তুতে প্রকাশ করা হয় (স্বতন্ত্র অংশগ্রহণকারীদের কাছ থেকে n=5টি বায়োপসি, প্রতিটি অংশগ্রহণকারীর দ্রুত এবং ধীর পেশী তন্তুর তুলনা করে)। পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণটি Limm রৈখিক মডেল পদ্ধতি ব্যবহার করে একটি অভিজ্ঞতামূলক বেয়েসিয়ান পদ্ধতির সাথে মিলিত করা হয়েছিল, তারপরে p-মান সমন্বয়ের সাথে একাধিক তুলনার জন্য বেঞ্জামিনী-হচবার্গ পদ্ধতি অনুসরণ করা হয়েছিল। বাক্স প্লটগুলি মধ্যমা, প্রথম এবং তৃতীয় কোয়ার্টাইল দেখায়, যেখানে কাঁটাগুলি সর্বোচ্চ/সর্বনিম্ন মান নির্দেশ করে।
সম্প্রতি, গবেষণায় দেখা গেছে যে অনেক পুটিভেটিভ নন-কোডিং ট্রান্সক্রিপ্ট ট্রান্সক্রিপশন করা মাইক্রোবিয়াল প্রোটিনকে এনকোড করে, যার মধ্যে কিছু পেশীর কার্যকারিতা নিয়ন্ত্রণ করে। 44, 55 সম্ভাব্য ফাইবার ধরণের নির্দিষ্টতা সহ মাইক্রোবিয়াল প্রোটিন সনাক্ত করার জন্য, আমরা 1000 ফাইবার ট্রান্সক্রিপ্টোম ডেটাসেটে (চিত্র 5D) পাওয়া নন-কোডিং ট্রান্সক্রিপ্টের ক্রম (n = 305) ধারণকারী একটি কাস্টম FASTA ফাইল ব্যবহার করে আমাদের 1000 ফাইবার প্রোটিওম ডেটাসেট অনুসন্ধান করেছি। আমরা 22টি ভিন্ন ট্রান্সক্রিপ্ট থেকে 197টি মাইক্রোবিয়াল প্রোটিন সনাক্ত করেছি, যার মধ্যে 71টি ধীর এবং দ্রুত কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলির মধ্যে পৃথকভাবে নিয়ন্ত্রিত ছিল (পরিপূরক চিত্র 9C এবং পরিপূরক ডেটা সেট 16)। LINC01405 এর জন্য, তিনটি মাইক্রোবিয়াল প্রোটিন পণ্য সনাক্ত করা হয়েছিল, যার মধ্যে একটি তার ট্রান্সক্রিপ্টের অনুরূপ ধীর ফাইবার নির্দিষ্টতা দেখিয়েছিল (চিত্র 5E এবং পরিপূরক চিত্র 9D)। এইভাবে, আমরা LINC01405 কে ধীর কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলির জন্য নির্দিষ্ট একটি মাইক্রোবিয়াল প্রোটিন এনকোডিংকারী জিন হিসাবে চিহ্নিত করেছি।
আমরা সুস্থ অবস্থায় পৃথক পেশী তন্তু এবং ফাইবার বৈচিত্র্যের নিয়ন্ত্রকদের বৃহৎ পরিসরে প্রোটিয়ামিক বৈশিষ্ট্য নির্ধারণের জন্য একটি বিস্তৃত কর্মপ্রবাহ তৈরি করেছি। নেমালাইন মায়োপ্যাথিগুলি কীভাবে কঙ্কালের পেশী তন্তু বৈচিত্র্যকে প্রভাবিত করে তা বোঝার জন্য আমরা এই কর্মপ্রবাহটি প্রয়োগ করেছি। নেমালাইন মায়োপ্যাথিগুলি হল উত্তরাধিকারসূত্রে প্রাপ্ত পেশী রোগ যা পেশী দুর্বলতা সৃষ্টি করে এবং আক্রান্ত শিশুদের ক্ষেত্রে, শ্বাসকষ্ট, স্কোলিওসিস এবং সীমিত অঙ্গ-প্রত্যঙ্গের গতিশীলতা সহ বিভিন্ন জটিলতা দেখা দেয়। 19,20 সাধারণত, নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে, অ্যাক্টিন আলফা 1 (ACTA1) এর মতো জিনের প্যাথোজেনিক রূপগুলি ধীর-টুইচ ফাইবার মায়োফাইবার গঠনের প্রাধান্য দেয়, যদিও এই প্রভাবটি ভিন্নধর্মী। একটি উল্লেখযোগ্য ব্যতিক্রম হল ট্রোপোনিন T1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি (TNNT1), যার মধ্যে দ্রুত তন্তুর প্রাধান্য রয়েছে। সুতরাং, নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে পরিলক্ষিত কঙ্কালের পেশী তন্তুর অব্যবস্থার অন্তর্নিহিত বৈচিত্র্য সম্পর্কে আরও ভালভাবে বোঝা এই রোগগুলি এবং মায়োফাইবার ধরণের মধ্যে জটিল সম্পর্ক উন্মোচন করতে সহায়তা করতে পারে।
সুস্থ নিয়ন্ত্রণের (প্রতি গ্রুপে n=3) তুলনা করলে, ACTA1 এবং TNNT1 জিনে মিউটেশন সহ নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগীদের থেকে বিচ্ছিন্ন মায়োফাইবারগুলিতে চিহ্নিত মায়োফাইবার অ্যাট্রোফি বা ডিস্ট্রফি দেখা গেছে (চিত্র 6A, পরিপূরক সারণী 3)। সীমিত পরিমাণে উপলব্ধ উপাদানের কারণে এটি প্রোটিওমিক বিশ্লেষণের জন্য উল্লেখযোগ্য প্রযুক্তিগত চ্যালেঞ্জ উপস্থাপন করেছে। তা সত্ত্বেও, আমরা 272টি কঙ্কালের মায়োপ্যাথিতে 2485টি প্রোটিন সনাক্ত করতে সক্ষম হয়েছি। প্রতি ফাইবারে কমপক্ষে 1000টি পরিমাণযুক্ত প্রোটিন ফিল্টার করার পরে, 250টি ফাইবার পরবর্তী জৈব-তত্ত্ব বিশ্লেষণের শিকার হয়েছিল। ফিল্টার করার পরে, প্রতি ফাইবারে গড়ে 1573 ± 359 প্রোটিন পরিমাপ করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 10A, পরিপূরক ডেটা সেট 17-18)। উল্লেখযোগ্যভাবে, ফাইবারের আকার উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস সত্ত্বেও, নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগীর নমুনার প্রোটিওম গভীরতা কেবলমাত্র সামান্য হ্রাস পেয়েছে। অধিকন্তু, আমাদের নিজস্ব FASTA ফাইল (নন-কোডিং ট্রান্সক্রিপ্ট সহ) ব্যবহার করে এই ডেটা প্রক্রিয়াকরণের মাধ্যমে আমরা নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগীদের কঙ্কালের মায়োফাইবারে পাঁচটি মাইক্রোবিয়াল প্রোটিন সনাক্ত করতে পেরেছি (পরিপূরক ডেটা সেট 19)। প্রোটিওমের গতিশীল পরিসর উল্লেখযোগ্যভাবে বিস্তৃত ছিল এবং নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর মোট প্রোটিনগুলি পূর্ববর্তী 1000-ফাইবার প্রোটিওম বিশ্লেষণের ফলাফলের সাথে ভালভাবে সম্পর্কযুক্ত ছিল (পরিপূরক চিত্র 10B-C)।
A. ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে (NM) MYH-এর উপর ভিত্তি করে ফাইবার অ্যাট্রোফি বা ডিস্ট্রফি এবং বিভিন্ন ধরণের ফাইবারের প্রাধান্য দেখানো মাইক্রোস্কোপিক ছবি। স্কেল বার = 100 μm। ACTA1 এবং TNNT1 রোগীদের মধ্যে দাগের পুনরুৎপাদনযোগ্যতা নিশ্চিত করার জন্য, প্রতিনিধিত্বমূলক ছবি নির্বাচন করার আগে তিনটি রোগীর বায়োপসি দুই থেকে তিনবার (প্রতি ক্ষেত্রে চারটি বিভাগ) দাগ দেওয়া হয়েছিল। B. MYH-এর উপর ভিত্তি করে অংশগ্রহণকারীদের মধ্যে ফাইবার ধরণের অনুপাত। C. নেমালাইন মায়োপ্যাথি এবং নিয়ন্ত্রণ রোগীদের কঙ্কালের পেশী তন্তুর প্রধান উপাদান বিশ্লেষণ (PCA) প্লট। D. চিত্র 2-এ বিশ্লেষণ করা 1000 ফাইবার থেকে নির্ধারিত একটি PCA প্লটে নেমালাইন মায়োপ্যাথি এবং নিয়ন্ত্রণ রোগীদের কঙ্কাল পেশী তন্তু প্রজেক্ট করা হয়েছে। উদাহরণস্বরূপ, ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি এবং নিয়ন্ত্রণ সহ অংশগ্রহণকারীদের মধ্যে পার্থক্য তুলনা করে আগ্নেয়গিরির প্লট। রঙিন বৃত্তগুলি এমন প্রোটিনগুলিকে নির্দেশ করে যা π < 0.05 এ উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন ছিল এবং গাঢ় বিন্দুগুলি FDR < 0.05 এ উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন ছিল এমন প্রোটিনগুলিকে নির্দেশ করে। পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ লিমা লিনিয়ার মডেল পদ্ধতি এবং অভিজ্ঞতামূলক বেয়েসিয়ান পদ্ধতি ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল, তারপরে বেঞ্জামিনী-হচবার্গ পদ্ধতি ব্যবহার করে একাধিক তুলনার জন্য p-মান সমন্বয় করা হয়েছিল। H. সমগ্র প্রোটিওম এবং টাইপ 1 এবং 2A ফাইবারগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্নভাবে প্রকাশিত প্রোটিনের সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ। ক্লাস্টার প্রোফাইলার প্যাকেজ এবং বেঞ্জামিনী-হচবার্গ সমন্বিত p-মান ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। I, J. প্রিন্সিপাল কম্পোনেন্ট বিশ্লেষণ (PCA) প্লটগুলি বহির্কোষীয় ম্যাট্রিক্স এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল জিন অনটোলজি (GO) পদ দ্বারা রঙিন।
যেহেতু নেমালাইন মায়োপ্যাথি কঙ্কালের পেশীতে MYH-প্রকাশকারী মায়োফাইবার ধরণের অনুপাতকে প্রভাবিত করতে পারে, 19,20 আমরা প্রথমে নেমালাইন মায়োপ্যাথি এবং নিয়ন্ত্রণ রোগীদের মধ্যে MYH-প্রকাশকারী মায়োফাইবার ধরণের পরীক্ষা করেছিলাম। আমরা 1000 মায়োফাইবার অ্যাসের জন্য পূর্বে বর্ণিত একটি নিরপেক্ষ পদ্ধতি ব্যবহার করে মায়োফাইবারের ধরণ নির্ধারণ করেছি (পরিপূরক চিত্র 10D–E) এবং আবারও বিশুদ্ধ 2X মায়োফাইবার সনাক্ত করতে ব্যর্থ হয়েছি (চিত্র 6B)। আমরা মায়োফাইবার ধরণের উপর নেমালাইন মায়োপ্যাথির একটি ভিন্নধর্মী প্রভাব লক্ষ্য করেছি, কারণ ACTA1 মিউটেশনের দুই রোগীর টাইপ 1 মায়োফাইবারের অনুপাত বৃদ্ধি পেয়েছিল, যেখানে TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথির দুই রোগীর টাইপ 1 মায়োফাইবারের অনুপাত হ্রাস পেয়েছিল (চিত্র 6B)। প্রকৃতপক্ষে, ACTA1-নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে MYH2 এবং দ্রুত ট্রোপোনিন আইসোফর্মের (TNNC2, TNNI2, এবং TNNT3) প্রকাশ হ্রাস পেয়েছে, যেখানে TNNT1-নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে MYH7 প্রকাশ হ্রাস পেয়েছে (পরিপূরক চিত্র 11A)। এটি নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে ভিন্ন ভিন্ন মায়োফাইবার টাইপ স্যুইচিংয়ের পূর্ববর্তী প্রতিবেদনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। 19,20 আমরা ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি দ্বারা এই ফলাফলগুলি নিশ্চিত করেছি এবং দেখেছি যে ACTA1-নেমালাইন মায়োপ্যাথির রোগীদের টাইপ 1 মায়োফাইবারের প্রাধান্য ছিল, যেখানে TNNT1-নেমালাইন মায়োপ্যাথির রোগীদের বিপরীত প্যাটার্ন ছিল (চিত্র 6A)।
একক-ফাইবার প্রোটিওম স্তরে, ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগীদের কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলি বেশিরভাগ নিয়ন্ত্রণ তন্তুর সাথে একত্রিত হয়েছিল, যেখানে TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি তন্তুগুলি সাধারণত সবচেয়ে বেশি প্রভাবিত হয় (চিত্র 6C)। প্রতিটি রোগীর জন্য ছদ্ম-স্ফীত তন্তুগুলির প্রধান উপাদান বিশ্লেষণ (PCA) প্লট প্লট করার সময় এটি বিশেষভাবে স্পষ্ট ছিল, যেখানে TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগী 2 এবং 3 নিয়ন্ত্রণ নমুনা থেকে সবচেয়ে দূরে প্রদর্শিত হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 11B, পরিপূরক ডেটা সেট 20)। মায়োপ্যাথি রোগীদের তন্তুগুলি সুস্থ তন্তুগুলির সাথে কীভাবে তুলনা করে তা আরও ভালভাবে বোঝার জন্য, আমরা সুস্থ প্রাপ্তবয়স্ক অংশগ্রহণকারীদের 1,000 তন্তুর প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ থেকে প্রাপ্ত বিশদ তথ্য ব্যবহার করেছি। আমরা 1000-ফাইবার প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ (চিত্র 6D) থেকে প্রাপ্ত PCA প্লটে মায়োপ্যাথি ডেটাসেট (ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগী এবং নিয়ন্ত্রণ) থেকে তন্তুগুলি প্রজেক্ট করেছি। কন্ট্রোল ফাইবারগুলিতে PC2 বরাবর MYH ফাইবার ধরণের বন্টন 1000-ফাইবার প্রোটিয়ামিক বিশ্লেষণ থেকে প্রাপ্ত ফাইবার বিতরণের অনুরূপ ছিল। তবে, নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগীদের বেশিরভাগ ফাইবার PC2 এর নিচে স্থানান্তরিত হয়, সুস্থ ফাস্ট-টুইচ ফাইবারের সাথে ওভারল্যাপ করে, তাদের স্থানীয় MYH ফাইবার ধরণের নির্বিশেষে। সুতরাং, যদিও ACTA1 নেমালাইন মায়োপ্যাথির রোগীরা MYH-ভিত্তিক পদ্ধতি ব্যবহার করে পরিমাণ নির্ধারণ করার সময় টাইপ 1 ফাইবারের দিকে স্থানান্তরিত হন, ACTA1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি উভয়ই কঙ্কালের পেশী ফাইবার প্রোটিওমকে দ্রুত-টুইচ ফাইবারের দিকে স্থানান্তরিত করে।
এরপর আমরা প্রতিটি রোগীর গ্রুপকে সুস্থ নিয়ন্ত্রণের সাথে সরাসরি তুলনা করেছিলাম এবং ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে যথাক্রমে 256 এবং 552 টি পৃথকভাবে প্রকাশিত প্রোটিন সনাক্ত করেছি (চিত্র 6E-G এবং পরিপূরক চিত্র 11C, পরিপূরক ডেটা সেট 21)। জিন সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণে মাইটোকন্ড্রিয়াল প্রোটিনের সমন্বিত হ্রাস প্রকাশ পেয়েছে (চিত্র 6H-I, পরিপূরক ডেটা সেট 22)। আশ্চর্যজনকভাবে, ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে ফাইবার ধরণের ডিফারেনশিয়াল প্রাধান্য থাকা সত্ত্বেও, এই হ্রাস MYH-ভিত্তিক ফাইবার ধরণের থেকে সম্পূর্ণ স্বাধীন ছিল (চিত্র 6H এবং পরিপূরক চিত্র 11D-I, পরিপূরক ডেটা সেট 23)। ACTA1 বা TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে তিনটি মাইক্রোবায়াল প্রোটিনও নিয়ন্ত্রিত হয়েছিল। এই দুটি মাইক্রোপ্রোটিন, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (যা LINC00598 বা Lnc-FOXO1 নামেও পরিচিত) এবং ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), শুধুমাত্র টাইপ 1 মায়োফাইবারগুলিতে ডিফারেনশিয়াল প্রাচুর্য দেখিয়েছে। ENSG00000215483_TR14_ORF67 পূর্বে কোষ চক্র নিয়ন্ত্রণে ভূমিকা পালন করে বলে জানা গেছে। 56 অন্যদিকে, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798 এর সাথে সম্পর্কিত) স্বাস্থ্যকর নিয়ন্ত্রণের তুলনায় ACTA1-নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে টাইপ 1 এবং টাইপ 2A মায়োফাইবার উভয় ক্ষেত্রেই বৃদ্ধি পেয়েছে (পরিপূরক চিত্র 12A, পরিপূরক ডেটা সেট 24)। বিপরীতে, রাইবোসোমাল প্রোটিনগুলি নেমালাইন মায়োপ্যাথি দ্বারা মূলত প্রভাবিত হয়নি, যদিও ACTA1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে RPS17 হ্রাস পেয়েছিল (চিত্র 6E)।
সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণে ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে রোগ প্রতিরোধ ব্যবস্থার প্রক্রিয়াগুলির আপরেগুলেশনও প্রকাশিত হয়েছে, যেখানে TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে কোষের আনুগত্যও বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 6H)। এই বহির্কোষীয় কারণগুলির সমৃদ্ধি প্রতিফলিত হয়েছে বহির্কোষীয় ম্যাট্রিক্স প্রোটিনগুলি PC1 এবং PC2-তে PCA কে নেতিবাচক দিকে (অর্থাৎ, সবচেয়ে বেশি প্রভাবিত তন্তুগুলির দিকে) স্থানান্তর করে (চিত্র 6J)। উভয় রোগীর দলই প্রতিরোধ প্রতিক্রিয়া এবং সারকোলেমাল মেরামত প্রক্রিয়ায় জড়িত বহির্কোষীয় প্রোটিনের বর্ধিত অভিব্যক্তি দেখিয়েছে, যেমন অ্যানেক্সিন (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 এবং তাদের মিথস্ক্রিয়াকারী প্রোটিন S100A1159 (পরিপূরক চিত্র 12B–C)। এই প্রক্রিয়াটি পূর্বে পেশীবহুল ডিসট্রোফিতে উন্নত বলে রিপোর্ট করা হয়েছে 60 কিন্তু, আমাদের জ্ঞান অনুসারে, পূর্বে নেমালাইন মায়োপ্যাথির সাথে যুক্ত ছিল না। আঘাতের পর সারকোলেমাল মেরামত এবং মায়োফাইবারের সাথে নবগঠিত মায়োসাইটগুলির সংমিশ্রণের জন্য এই আণবিক যন্ত্রপাতির স্বাভাবিক কার্যকারিতা প্রয়োজন58,61। সুতরাং, উভয় রোগীর গ্রুপে এই প্রক্রিয়ার বর্ধিত কার্যকলাপ মায়োফাইবার অস্থিরতার কারণে সৃষ্ট আঘাতের প্রতিকারমূলক প্রতিক্রিয়া নির্দেশ করে।
প্রতিটি নেমালাইন মায়োপ্যাথির প্রভাবগুলি ভালভাবে সম্পর্কিত ছিল (r = 0.736) এবং যুক্তিসঙ্গত ওভারল্যাপ দেখিয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 11A–B), যা নির্দেশ করে যে ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথির প্রোটিওমের উপর একই রকম প্রভাব রয়েছে। তবে, কিছু প্রোটিন শুধুমাত্র ACTA1 বা TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে নিয়ন্ত্রিত হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 11A এবং C)। প্রোফাইব্রোটিক প্রোটিন MFAP4 TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে সবচেয়ে আপরেগুলেটেড প্রোটিনগুলির মধ্যে একটি ছিল কিন্তু ACTA1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে অপরিবর্তিত ছিল। HOX জিন ট্রান্সক্রিপশন নিয়ন্ত্রণের জন্য দায়ী PAF1C কমপ্লেক্সের একটি উপাদান SKIC8, TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে হ্রাস পেয়েছিল কিন্তু ACTA1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে প্রভাবিত হয়নি (পরিপূরক চিত্র 11A)। ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথির সরাসরি তুলনা TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে মাইটোকন্ড্রিয়াল প্রোটিনের বৃহত্তর হ্রাস এবং রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতার প্রোটিনের বৃদ্ধি প্রকাশ করে (চিত্র 6G-H এবং পরিপূরক চিত্র 11C এবং 11H-I)। এই তথ্যগুলি TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথির (চিত্র 6A) তুলনায় TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে পরিলক্ষিত বৃহত্তর অ্যাট্রোফি/ডিস্ট্রফির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যা পরামর্শ দেয় যে TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগের আরও গুরুতর রূপকে প্রতিনিধিত্ব করে।
নেমালাইন মায়োপ্যাথির পর্যবেক্ষণকৃত প্রভাবগুলি পুরো পেশী স্তরে টিকে আছে কিনা তা মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগীদের একই দল থেকে পেশী বায়োপসির একটি বাল্ক প্রোটমিক বিশ্লেষণ করেছি এবং তাদের নিয়ন্ত্রণের সাথে তুলনা করেছি (প্রতি গ্রুপে n=3) (পরিপূরক চিত্র 13A, পরিপূরক ডেটা সেট 25)। প্রত্যাশিত হিসাবে, প্রধান উপাদান বিশ্লেষণে নিয়ন্ত্রণগুলি ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত ছিল, যেখানে TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগীদের একক ফাইবার বিশ্লেষণে দেখা যায় এমন উচ্চতর আন্তঃনমুনা পরিবর্তনশীলতা প্রদর্শন করেছে (পরিপূরক চিত্র 13B)। বাল্ক বিশ্লেষণ পৃথক তন্তুগুলির তুলনা করে হাইলাইট করা ডিফারেনশিয়ালি এক্সপ্রেসড প্রোটিন (পরিপূরক চিত্র 13C, পরিপূরক ডেটা সেট 26) এবং জৈবিক প্রক্রিয়াগুলি (পরিপূরক চিত্র 13D, পরিপূরক ডেটা সেট 27) পুনরুত্পাদন করেছে, কিন্তু বিভিন্ন তন্তুর ধরণের মধ্যে পার্থক্য করার ক্ষমতা হারিয়েছে এবং তন্তুগুলিতে ভিন্নধর্মী রোগের প্রভাবের জন্য হিসাব করতে ব্যর্থ হয়েছে।
একসাথে নেওয়া হলে, এই তথ্যগুলি প্রমাণ করে যে একক-মায়োফাইবার প্রোটিওমিক্স ক্লিনিকাল জৈবিক বৈশিষ্ট্যগুলি ব্যাখ্যা করতে পারে যা ইমিউনোব্লটিংয়ের মতো লক্ষ্যযুক্ত পদ্ধতি দ্বারা সনাক্ত করা যায় না। তদুপরি, এই তথ্যগুলি ফেনোটাইপিক অভিযোজন বর্ণনা করার জন্য শুধুমাত্র অ্যাক্টিন ফাইবার টাইপিং (MYH) ব্যবহারের সীমাবদ্ধতাগুলি তুলে ধরে। প্রকৃতপক্ষে, যদিও ফাইবার টাইপ স্যুইচিং অ্যাক্টিন এবং ট্রোপোনিন নেমালাইন মায়োপ্যাথির মধ্যে পার্থক্য করে, উভয় নেমালাইন মায়োপ্যাথিই MYH ফাইবার টাইপিংকে কঙ্কালের পেশী ফাইবার বিপাক থেকে দ্রুত এবং কম অক্সিডেটিভ পেশী প্রোটিওমের দিকে বিচ্ছিন্ন করে।
কোষীয় বৈচিত্র্য টিস্যুর বিভিন্ন চাহিদা পূরণের জন্য অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। কঙ্কালের পেশীতে, এটি প্রায়শই ফাইবারের ধরণ হিসাবে বর্ণনা করা হয় যা বিভিন্ন মাত্রার বল উৎপাদন এবং ক্লান্তি দ্বারা চিহ্নিত। তবে, এটি স্পষ্ট যে এটি কঙ্কালের পেশী ফাইবারের পরিবর্তনশীলতার একটি ছোট অংশকেই ব্যাখ্যা করে, যা পূর্বের ধারণার চেয়ে অনেক বেশি পরিবর্তনশীল, জটিল এবং বহুমুখী। প্রযুক্তিগত অগ্রগতি এখন কঙ্কালের পেশী ফাইবার নিয়ন্ত্রণকারী কারণগুলির উপর আলোকপাত করেছে। প্রকৃতপক্ষে, আমাদের তথ্য থেকে জানা যায় যে টাইপ 2X ফাইবার একটি স্বতন্ত্র কঙ্কালের পেশী ফাইবার উপপ্রকার নাও হতে পারে। অধিকন্তু, আমরা বিপাকীয় প্রোটিন, রাইবোসোমাল প্রোটিন এবং কোষ-সম্পর্কিত প্রোটিনকে কঙ্কালের পেশী ফাইবার বৈচিত্র্যের প্রধান নির্ধারক হিসাবে চিহ্নিত করেছি। নেমাটোড মায়োপ্যাথিতে আক্রান্ত রোগীর নমুনাগুলিতে আমাদের প্রোটিওমিক কর্মপ্রবাহ প্রয়োগ করে, আমরা আরও দেখিয়েছি যে MYH-ভিত্তিক ফাইবার টাইপিং কঙ্কালের পেশী বৈচিত্র্যকে সম্পূর্ণরূপে প্রতিফলিত করে না, বিশেষ করে যখন সিস্টেমটি বিঘ্নিত হয়। প্রকৃতপক্ষে, MYH-ভিত্তিক ফাইবারের ধরণ নির্বিশেষে, নেমাটোড মায়োপ্যাথি দ্রুত এবং কম অক্সিডেটিভ ফাইবারের দিকে স্থানান্তরিত করে।
উনিশ শতক থেকেই কঙ্কাল পেশী তন্তুগুলিকে শ্রেণীবদ্ধ করা হচ্ছে। সাম্প্রতিক ওমিক্স বিশ্লেষণগুলি আমাদের বিভিন্ন MYH ফাইবার ধরণের এক্সপ্রেশন প্রোফাইল এবং বিভিন্ন উদ্দীপনার প্রতি তাদের প্রতিক্রিয়া বুঝতে সাহায্য করেছে। এখানে বর্ণিত হিসাবে, ওমিক্স পদ্ধতির সুবিধা হল ঐতিহ্যবাহী অ্যান্টিবডি-ভিত্তিক পদ্ধতির তুলনায় ফাইবার ধরণের চিহ্নিতকারীর পরিমাণ নির্ধারণের জন্য বেশি সংবেদনশীলতা, একটি কঙ্কালের পেশী ফাইবারের ধরণ নির্ধারণের জন্য একক (অথবা কয়েকটি) চিহ্নিতকারীর পরিমাণ নির্ধারণের উপর নির্ভর না করে। আমরা পরিপূরক ট্রান্সক্রিপ্টমিক এবং প্রোটিওমিক কর্মপ্রবাহ ব্যবহার করেছি এবং মানব কঙ্কালের পেশী তন্তুতে ফাইবারের ভিন্নতার ট্রান্সক্রিপশনাল এবং পোস্ট-ট্রান্সক্রিপশনাল নিয়ন্ত্রণ পরীক্ষা করার জন্য ফলাফলগুলিকে একীভূত করেছি। এই কর্মপ্রবাহের ফলে আমাদের সুস্থ তরুণ পুরুষদের ভাস্টাস ল্যাটারালিসের প্রোটিন স্তরে বিশুদ্ধ 2X-টাইপ ফাইবার সনাক্ত করতে ব্যর্থ হয়েছে। এটি পূর্ববর্তী একক ফাইবার গবেষণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যা সুস্থ ভাস্টাস ল্যাটারালিসের <1% বিশুদ্ধ 2X ফাইবার খুঁজে পেয়েছিল, যদিও ভবিষ্যতে অন্যান্য পেশীতে এটি নিশ্চিত হওয়া উচিত। mRNA স্তরে প্রায় বিশুদ্ধ 2X তন্তু এবং প্রোটিন স্তরে শুধুমাত্র মিশ্র 2A/2X তন্তু সনাক্তকরণের মধ্যে পার্থক্য বিভ্রান্তিকর। MYH আইসোফর্ম mRNA অভিব্যক্তি সার্কাডিয়ান নয়, 67 যা ইঙ্গিত করে যে RNA স্তরে আপাতদৃষ্টিতে বিশুদ্ধ 2X তন্তুতে MYH2 সূত্রপাত সংকেত "মিস" করার সম্ভাবনা কম। একটি সম্ভাব্য ব্যাখ্যা, যদিও সম্পূর্ণরূপে কাল্পনিক, MYH আইসোফর্মের মধ্যে প্রোটিন এবং/অথবা mRNA স্থিতিশীলতার পার্থক্য হতে পারে। প্রকৃতপক্ষে, কোনও দ্রুত ফাইবার কোনও MYH আইসোফর্মের জন্য 100% বিশুদ্ধ নয়, এবং 70-90% পরিসরে MYH1 mRNA অভিব্যক্তি স্তরের ফলে প্রোটিন স্তরে MYH1 এবং MYH2 প্রাচুর্য সমান হবে কিনা তা স্পষ্ট নয়। যাইহোক, সম্পূর্ণ ট্রান্সক্রিপ্টোম বা প্রোটিওম বিবেচনা করার সময়, ক্লাস্টার বিশ্লেষণ আত্মবিশ্বাসের সাথে ধীর এবং দ্রুত কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলির প্রতিনিধিত্বকারী মাত্র দুটি স্বতন্ত্র ক্লাস্টার সনাক্ত করতে পারে, তাদের সুনির্দিষ্ট MYH গঠন নির্বিশেষে। এটি একক-নিউক্লিয়াস ট্রান্সক্রিপ্টোমিক পদ্ধতি ব্যবহার করে বিশ্লেষণের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যা সাধারণত কেবল দুটি স্বতন্ত্র মায়োনিউক্লিয়ার ক্লাস্টার সনাক্ত করে। 68, 69, 70 অধিকন্তু, যদিও পূর্ববর্তী প্রোটিওমিক গবেষণায় টাইপ 2X ফাইবার শনাক্ত করা হয়েছে, এই ফাইবারগুলি অন্যান্য দ্রুত ফাইবার থেকে আলাদাভাবে ক্লাস্টার করে না এবং MYH-এর উপর ভিত্তি করে অন্যান্য ফাইবার ধরণের তুলনায় কেবলমাত্র অল্প সংখ্যক ভিন্নভাবে প্রচুর প্রোটিন দেখায়। 14 এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে আমাদের 20 শতকের গোড়ার দিকে পেশী ফাইবার শ্রেণীবিভাগের দৃষ্টিভঙ্গিতে ফিরে যাওয়া উচিত, যা মানুষের কঙ্কালের পেশী ফাইবারগুলিকে MYH-এর উপর ভিত্তি করে তিনটি স্বতন্ত্র শ্রেণীতে নয়, বরং তাদের বিপাকীয় এবং সংকোচনশীল বৈশিষ্ট্যের উপর ভিত্তি করে দুটি ক্লাস্টারে বিভক্ত করেছিল। 63
আরও গুরুত্বপূর্ণ বিষয় হল, মায়োফাইবারের ভিন্নতা বহুমাত্রিকভাবে বিবেচনা করা উচিত। পূর্ববর্তী "অমিক্স" গবেষণাগুলি এই দিকে ইঙ্গিত করেছে, পরামর্শ দিয়েছে যে কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলি বিচ্ছিন্ন ক্লাস্টার গঠন করে না বরং একটি ধারাবাহিকতা বরাবর সাজানো থাকে। 11, 13, 14, 64, 71 এখানে, আমরা দেখাই যে, কঙ্কালের পেশীর সংকোচনশীল এবং বিপাকীয় বৈশিষ্ট্যের পার্থক্য ছাড়াও, মায়োফাইবারগুলিকে কোষ-কোষ মিথস্ক্রিয়া এবং অনুবাদ প্রক্রিয়া সম্পর্কিত বৈশিষ্ট্য দ্বারা আলাদা করা যেতে পারে। প্রকৃতপক্ষে, আমরা কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলিতে রাইবোসোম ভিন্নতা খুঁজে পেয়েছি যা ধীর এবং দ্রুত ফাইবারের ধরণ থেকে স্বাধীনভাবে ভিন্নতাতে অবদান রাখে। ধীর এবং দ্রুত ফাইবারের ধরণ থেকে স্বাধীন এই উল্লেখযোগ্য মায়োফাইবার ভিন্নতার অন্তর্নিহিত কারণটি এখনও অস্পষ্ট, তবে এটি পেশী ফ্যাসিকেলের মধ্যে বিশেষায়িত স্থানিক সংগঠনের দিকে ইঙ্গিত করতে পারে যা নির্দিষ্ট বল এবং লোডের প্রতি সর্বোত্তমভাবে সাড়া দেয়, 72 পেশী মাইক্রোএনভায়রনমেন্টে অন্যান্য কোষের ধরণের সাথে বিশেষায়িত কোষীয় বা অঙ্গ-নির্দিষ্ট যোগাযোগ 73,74,75 বা পৃথক মায়োফাইবারের মধ্যে রাইবোসোম কার্যকলাপের পার্থক্য। প্রকৃতপক্ষে, রাইবোসোমাল হেটেরোপ্লাজি, হয় RPL3 এবং RPL3L এর প্যারালোগাস প্রতিস্থাপনের মাধ্যমে অথবা rRNA এর 2′O-মিথাইলেশন স্তরে, কঙ্কালের পেশী হাইপারট্রফি76,77 এর সাথে সম্পর্কিত বলে প্রমাণিত হয়েছে। পৃথক মায়োফাইবারের কার্যকরী বৈশিষ্ট্যের সাথে মিলিত বহু-ওমিক এবং স্থানিক প্রয়োগগুলি বহু-ওমিক স্তরে পেশী জীববিজ্ঞান সম্পর্কে আমাদের বোঝাপড়াকে আরও এগিয়ে নিয়ে যাবে78।
নেমালাইন মায়োপ্যাথি রোগীদের একক মায়োফাইবারের প্রোটিওম বিশ্লেষণ করে, আমরা কঙ্কালের পেশীর ক্লিনিকাল প্যাথোফিজিওলজি ব্যাখ্যা করার জন্য একক মায়োফাইবার প্রোটিওমিক্সের উপযোগিতা, কার্যকারিতা এবং প্রযোজ্যতাও প্রদর্শন করেছি। তাছাড়া, আমাদের কর্মপ্রবাহের সাথে বিশ্বব্যাপী প্রোটিওমিক বিশ্লেষণের তুলনা করে, আমরা প্রমাণ করতে সক্ষম হয়েছি যে একক মায়োফাইবার প্রোটিওমিক্স বিশ্বব্যাপী টিস্যু প্রোটিওমিক্সের মতো একই গভীরতার তথ্য প্রদান করে এবং ইন্টারফাইবার ভিন্নতা এবং মায়োফাইবার ধরণের হিসাব করে এই গভীরতা প্রসারিত করে। সুস্থ নিয়ন্ত্রণের তুলনায় ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে পরিলক্ষিত ফাইবার ধরণের অনুপাতের প্রত্যাশিত (পরিবর্তনশীল হলেও) পার্থক্য ছাড়াও,19 আমরা MYH-মধ্যস্থ ফাইবার ধরণের স্যুইচিং থেকে স্বাধীনভাবে অক্সিডেটিভ এবং বহির্কোষীয় পুনর্নির্মাণও পর্যবেক্ষণ করেছি। TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে পূর্বে ফাইব্রোসিস রিপোর্ট করা হয়েছে।19 তবে, আমাদের বিশ্লেষণ এই আবিষ্কারের উপর ভিত্তি করে তৈরি করে, ACTA1 এবং TNNT1 নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে আক্রান্ত রোগীদের মায়োফাইবারে সারকোলেমাল মেরামত প্রক্রিয়ায় জড়িত অ্যানেক্সিনের মতো বহির্কোষীয় নিঃসৃত স্ট্রেস-সম্পর্কিত প্রোটিনের বর্ধিত মাত্রা প্রকাশ করে।57,58,59 উপসংহারে, নেমালাইন মায়োপ্যাথিতে আক্রান্ত রোগীদের মায়োফাইবারে অ্যানেক্সিনের মাত্রা বৃদ্ধি গুরুতরভাবে অ্যাট্রোফিক মায়োপ্যাথি মেরামতের জন্য একটি কোষীয় প্রতিক্রিয়ার প্রতিনিধিত্ব করতে পারে।
যদিও এই গবেষণাটি এখন পর্যন্ত মানুষের উপর সবচেয়ে বড় একক-তন্তুর সম্পূর্ণ-পেশী-অমিক্স বিশ্লেষণের প্রতিনিধিত্ব করে, এটি সীমাবদ্ধতামুক্ত নয়। আমরা অংশগ্রহণকারীদের তুলনামূলকভাবে ছোট এবং সমজাতীয় নমুনা এবং একটি একক পেশী (ভাস্টাস ল্যাটারালিস) থেকে কঙ্কালের পেশী তন্তুগুলিকে আলাদা করেছি। অতএব, পেশী ধরণের এবং পেশী শারীরবৃত্তীয় স্তরের উপর নির্দিষ্ট ফাইবার জনসংখ্যার অস্তিত্ব বাদ দেওয়া অসম্ভব। উদাহরণস্বরূপ, আমরা উচ্চ প্রশিক্ষিত স্প্রিন্টার এবং/অথবা শক্তির ক্রীড়াবিদদের মধ্যে বা পেশী নিষ্ক্রিয়তার সময়কালে অতি দ্রুত ফাইবারের (যেমন, বিশুদ্ধ 2X ফাইবার) একটি উপসেট উদ্ভূত হওয়ার সম্ভাবনা বাদ দিতে পারি না66,80। অধিকন্তু, অংশগ্রহণকারীদের সীমিত নমুনার আকার আমাদের ফাইবারের ভিন্নতার লিঙ্গ পার্থক্য তদন্ত করতে বাধা দেয়, কারণ ফাইবার ধরণের অনুপাত পুরুষ এবং মহিলাদের মধ্যে ভিন্ন বলে জানা যায়। অধিকন্তু, আমরা একই পেশী তন্তু বা একই অংশগ্রহণকারীদের নমুনার উপর ট্রান্সক্রিপ্টমিক এবং প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ পরিচালনা করতে পারিনি। আমরা এবং অন্যরা যখন অতি-নিম্ন নমুনা ইনপুট অর্জনের জন্য ওমিক্স বিশ্লেষণ ব্যবহার করে একক-কোষ এবং একক-মায়োফাইবার বিশ্লেষণকে অপ্টিমাইজ করতে থাকি (যেমন মাইটোকন্ড্রিয়াল মায়োপ্যাথির রোগীদের তন্তু বিশ্লেষণে এখানে দেখানো হয়েছে), তখন একক পেশী তন্তুর মধ্যে বহু-ওমিক্স (এবং কার্যকরী) পদ্ধতিগুলিকে একত্রিত করার সুযোগ স্পষ্ট হয়ে ওঠে।
সামগ্রিকভাবে, আমাদের তথ্য কঙ্কালের পেশী বৈচিত্র্যের ট্রান্সক্রিপশনাল এবং পোস্ট-ট্রান্সক্রিপশনাল চালিকাশক্তি সনাক্ত করে এবং ব্যাখ্যা করে। বিশেষ করে, আমরা এমন তথ্য উপস্থাপন করি যা ফাইবার প্রকারের ধ্রুপদী MYH-ভিত্তিক সংজ্ঞার সাথে সম্পর্কিত কঙ্কালের পেশী শারীরবিদ্যার দীর্ঘস্থায়ী মতবাদকে চ্যালেঞ্জ করে। আমরা বিতর্কটি পুনর্নবীকরণ করার এবং শেষ পর্যন্ত কঙ্কালের পেশী ফাইবার শ্রেণীবিভাগ এবং বৈচিত্র্য সম্পর্কে আমাদের বোঝার পুনর্বিবেচনা করার আশা করি।
চৌদ্দ জন ককেশীয় অংশগ্রহণকারী (১২ জন পুরুষ এবং ২ জন মহিলা) স্বেচ্ছায় এই গবেষণায় অংশগ্রহণ করতে সম্মত হন। গবেষণাটি ঘেন্ট বিশ্ববিদ্যালয় হাসপাতালের নীতিশাস্ত্র কমিটি (BC-10237) দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল, ২০১৩ সালের হেলসিঙ্কি ঘোষণাপত্র মেনে চলে এবং ClinicalTrials.gov (NCT05131555) এ নিবন্ধিত হয়েছিল। অংশগ্রহণকারীদের সাধারণ বৈশিষ্ট্যগুলি পরিপূরক সারণি ১ এ উপস্থাপন করা হয়েছে। মৌখিক এবং লিখিত অবহিত সম্মতি পাওয়ার পর, গবেষণায় চূড়ান্ত অন্তর্ভুক্তির আগে অংশগ্রহণকারীদের একটি মেডিকেল পরীক্ষা করা হয়েছিল। অংশগ্রহণকারীরা তরুণ (২২-৪২ বছর), সুস্থ (কোনও চিকিৎসাগত অবস্থা ছিল না, ধূমপানের ইতিহাস ছিল না) এবং মাঝারিভাবে শারীরিকভাবে সক্রিয় ছিলেন। পূর্বে বর্ণিত শারীরিক সুস্থতা মূল্যায়নের জন্য একটি স্টেপ এরগোমিটার ব্যবহার করে সর্বাধিক অক্সিজেন গ্রহণ নির্ধারণ করা হয়েছিল। 81
পেশী বায়োপসি নমুনাগুলি বিশ্রামে এবং উপবাস অবস্থায় তিনবার, ১৪ দিনের ব্যবধানে সংগ্রহ করা হয়েছিল। যেহেতু এই নমুনাগুলি একটি বৃহত্তর গবেষণার অংশ হিসাবে সংগ্রহ করা হয়েছিল, অংশগ্রহণকারীরা বায়োপসির ৪০ মিনিট আগে প্লেসিবো (ল্যাকটোজ), একটি H1-রিসেপ্টর প্রতিপক্ষ (540 মিলিগ্রাম ফেক্সোফেনাডিন), বা একটি H2-রিসেপ্টর প্রতিপক্ষ (40 মিলিগ্রাম ফ্যামোটিডিন) গ্রহণ করেছিলেন। আমরা পূর্বে প্রমাণ করেছি যে এই হিস্টামিন রিসেপ্টর প্রতিপক্ষগুলি বিশ্রামের কঙ্কালের পেশীর সুস্থতাকে প্রভাবিত করে না81, এবং আমাদের মান নিয়ন্ত্রণ প্লটে কোনও অবস্থা-সম্পর্কিত ক্লাস্টারিং পরিলক্ষিত হয়নি (পরিপূরক চিত্র 3 এবং 6)। প্রতিটি পরীক্ষামূলক দিনের 48 ঘন্টা আগে একটি মানসম্মত খাদ্য (41.4 কিলোক্যালরি/কেজি শরীরের ওজন, 5.1 গ্রাম/কেজি শরীরের ওজন কার্বোহাইড্রেট, 1.4 গ্রাম/কেজি শরীরের ওজন প্রোটিন, এবং 1.6 গ্রাম/কেজি শরীরের ওজন ফ্যাট) বজায় রাখা হয়েছিল এবং পরীক্ষামূলক দিনের সকালে একটি মানসম্মত নাস্তা (1.5 গ্রাম/কেজি শরীরের ওজন কার্বোহাইড্রেট) গ্রহণ করা হয়েছিল। স্থানীয় অ্যানেস্থেসিয়ার অধীনে (০.৫ মিলি ১% লিডোকেইন, এপিনেফ্রিন ছাড়া), পারকিউটেনিয়াস বার্গস্ট্রোম অ্যাসপিরেশন ব্যবহার করে ভাস্টাস ল্যাটারালিস পেশী থেকে পেশী বায়োপসি নেওয়া হয়েছিল।82 পেশীর নমুনাগুলি তাৎক্ষণিকভাবে RNAlater-এ এমবেড করা হয়েছিল এবং ম্যানুয়াল ফাইবার বিচ্ছেদ (৩ দিন পর্যন্ত) পর্যন্ত ৪°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল।
নতুন করে বিচ্ছিন্ন মায়োফাইবার বান্ডিলগুলিকে একটি কালচার ডিশে তাজা RNAlater মাধ্যমে স্থানান্তর করা হয়েছিল। তারপর পৃথক মায়োফাইবারগুলিকে স্টেরিওমাইক্রোস্কোপ এবং সূক্ষ্ম টুইজার ব্যবহার করে ম্যানুয়ালি ব্যবচ্ছেদ করা হয়েছিল। প্রতিটি বায়োপসি থেকে পঁচিশটি ফাইবার ব্যবচ্ছেদ করা হয়েছিল, বায়োপসির বিভিন্ন অংশ থেকে ফাইবার নির্বাচনের দিকে বিশেষ মনোযোগ দেওয়া হয়েছিল। ব্যবচ্ছেদের পরে, প্রতিটি ফাইবারকে অবাঞ্ছিত প্রোটিন এবং ডিএনএ অপসারণের জন্য প্রোটিনেজ কে এবং ডিএনএস এনজাইম ধারণকারী 3 μl লাইসিস বাফারে (সিঙ্গেলশট সেল লাইসিস কিট, বায়ো-রেড) আলতো করে ডুবিয়ে দেওয়া হয়েছিল। এরপর কোষের লাইসিস এবং প্রোটিন/ডিএনএ অপসারণ সংক্ষিপ্ত ঘূর্ণি দ্বারা শুরু করা হয়েছিল, একটি মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজে তরলটি ঘুরিয়ে এবং ঘরের তাপমাত্রায় (10 মিনিট) ইনকিউবেশন করা হয়েছিল। এরপর লাইসেটটিকে একটি থার্মাল সাইক্লারে (T100, বায়ো-রেড) 37°C তাপমাত্রায় 5 মিনিটের জন্য, 75°C তাপমাত্রায় 5 মিনিটের জন্য ইনকিউবেশন করা হয়েছিল এবং তারপরে পরবর্তী প্রক্রিয়াকরণ না হওয়া পর্যন্ত -80°C তাপমাত্রায় অবিলম্বে সংরক্ষণ করা হয়েছিল।
ইলুমিনা-সামঞ্জস্যপূর্ণ পলিঅ্যাডেনাইলেটেড আরএনএ লাইব্রেরিগুলি কোয়ান্টসেক-পুল 3′ এমআরএনএ-সেক লাইব্রেরি প্রিপ কিট (লেক্সোজেন) ব্যবহার করে 2 µl মায়োফাইবার লাইসেট থেকে প্রস্তুত করা হয়েছিল। বিস্তারিত পদ্ধতিগুলি প্রস্তুতকারকের ম্যানুয়ালটিতে পাওয়া যাবে। প্রক্রিয়াটি বিপরীত ট্রান্সক্রিপশনের মাধ্যমে প্রথম-স্ট্র্যান্ড সিডিএনএ সংশ্লেষণ দিয়ে শুরু হয়, যার সময় নমুনাগুলির পুলিং নিশ্চিত করতে এবং ডাউনস্ট্রিম প্রক্রিয়াকরণের সময় প্রযুক্তিগত পরিবর্তনশীলতা হ্রাস করার জন্য অনন্য আণবিক শনাক্তকারী (UMI) এবং নমুনা-নির্দিষ্ট i1 বারকোড প্রবর্তন করা হয়। 96টি মায়োফাইবার থেকে সিডিএনএ তারপর পুল করা হয় এবং চৌম্বকীয় পুঁতি দিয়ে বিশুদ্ধ করা হয়, তারপরে আরএনএ সরানো হয় এবং র্যান্ডম প্রাইমার ব্যবহার করে দ্বিতীয়-স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষণ করা হয়। লাইব্রেরিটি চৌম্বকীয় পুঁতি দিয়ে বিশুদ্ধ করা হয়, পুল-নির্দিষ্ট i5/i7 ট্যাগ যুক্ত করা হয় এবং পিসিআর প্রশস্ত করা হয়। একটি চূড়ান্ত পরিশোধন পদক্ষেপ ইলুমিনা-সামঞ্জস্যপূর্ণ লাইব্রেরি তৈরি করে। উচ্চ সংবেদনশীলতা ক্ষুদ্র খণ্ড ডিএনএ বিশ্লেষণ কিট (অ্যাজিলেন্ট টেকনোলজিস, DNF-477-0500) ব্যবহার করে প্রতিটি লাইব্রেরি পুলের গুণমান মূল্যায়ন করা হয়েছিল।
কিউবিট কোয়ান্টিফিকেশনের উপর ভিত্তি করে, পুলগুলিকে সমতুল্য ঘনত্বে (2 nM) আরও পুল করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ পুলটি 2 nM লোডিং (4% PhiX) সহ NovaSeq S2 রিএজেন্ট কিট (1 × 100 নিউক্লিওটাইড) ব্যবহার করে স্ট্যান্ডার্ড মোডে একটি NovaSeq 6000 যন্ত্রে সিকোয়েন্স করা হয়েছিল।
আমাদের পাইপলাইনটি Lexogen-এর QuantSeq Pool ডেটা বিশ্লেষণ পাইপলাইন (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) এর উপর ভিত্তি করে তৈরি। i7/i5 সূচকের উপর ভিত্তি করে bcl2fastq2 (v2.20.0) দিয়ে ডেটা প্রথমে ডিমাল্টিপ্লেক্স করা হয়েছিল। তারপর i1 নমুনা বারকোডের উপর ভিত্তি করে idemux (v0.1.6) দিয়ে রিড 2 কে ডিমাল্টিপ্লেক্স করা হয়েছিল এবং umi_tools (v1.0.1) দিয়ে UMI সিকোয়েন্সগুলি বের করা হয়েছিল। এরপর ছোট রিড (<20 দৈর্ঘ্য) বা শুধুমাত্র অ্যাডাপ্টার সিকোয়েন্স সমন্বিত রিডগুলি অপসারণ করার জন্য একাধিক রাউন্ডে কাটঅ্যাডাপ্ট (v3.4) দিয়ে রিডগুলি ছাঁটাই করা হয়েছিল। তারপর STAR (v2.6.0c) ব্যবহার করে রিডগুলি মানব জিনোমের সাথে সারিবদ্ধ করা হয়েছিল এবং BAM ফাইলগুলি SAMtools (v1.11) দিয়ে সূচীবদ্ধ করা হয়েছিল। umi_tools (v1.0.1) ব্যবহার করে ডুপ্লিকেট রিডগুলি সরানো হয়েছিল। অবশেষে, সাবরিড (v2.0.3) এ featureCount ব্যবহার করে অ্যালাইনমেন্ট গণনা করা হয়েছিল। পাইপলাইনের বেশ কয়েকটি মধ্যবর্তী পর্যায়ে FastQC (v0.11.9) ব্যবহার করে মান নিয়ন্ত্রণ করা হয়েছিল।
সমস্ত পরবর্তী জৈব-তথ্য প্রক্রিয়াকরণ এবং ভিজ্যুয়ালাইজেশন R (v4.2.3) তে সম্পাদিত হয়েছিল, প্রাথমিকভাবে Seurat (v4.4.0) ওয়ার্কফ্লো ব্যবহার করে। 83 অতএব, পৃথক UMI মান এবং মেটাডেটা ম্যাট্রিক্স Seurat বস্তুতে রূপান্তরিত হয়েছিল। সমস্ত ফাইবারের 30% এরও কমতে প্রকাশিত জিনগুলি সরানো হয়েছিল। ন্যূনতম 1000 UMI মান এবং 1000 সনাক্ত করা জিনের থ্রেশহোল্ডের ভিত্তিতে নিম্ন-মানের নমুনাগুলি সরানো হয়েছিল। পরিশেষে, 925 ফাইবার সমস্ত মান নিয়ন্ত্রণ ফিল্টারিং ধাপ অতিক্রম করেছে। Seurat SCTransform v2 পদ্ধতি ব্যবহার করে UMI মানগুলি স্বাভাবিক করা হয়েছিল, 84 টি সনাক্ত করা সমস্ত 7418 বৈশিষ্ট্য সহ, এবং অংশগ্রহণকারীদের মধ্যে পার্থক্যগুলি হ্রাস করা হয়েছিল। সমস্ত প্রাসঙ্গিক মেটাডেটা পরিপূরক ডেটাসেট 28 এ পাওয়া যাবে।